HISTOLOKE TEHNIKE 24022021 alen vukeli dr 1 l

HISTOLOŠKE TEHNIKE 24/02/2021 alen vukelić, dr 1

l HISTOLOŠKA tehnika podrazumijeva uzimanje malih dijelova tkiva ili organa, fiksaciju i sve oblike pripreme histološkog preparata. 24/02/2021 alen vukelić, dr 2

Cilj histološke tehnike l Napraviti kvalitetan histološki preparat u svrhu mikroskopske analize tkiva. l Najčešće se koristi u patohistologiji, gdje se žele proučiti patološke promjene tkiva na mikroskopskoj razini. 24/02/2021 alen vukelić, dr 3

l Većina bolesti zahtjeva patohistološku analizu i njihova konačna dijagnoza postavlja se tek nakon nalaza patologa. l Ovo se prvenstveno odnosi na neoplazme, autoimune bolesti. . . 24/02/2021 alen vukelić, dr 4

Uzimanje materijala l Kada govorimo o uzimanju materijala najčešće mislimo na BIOPSIJU. l Grč. bios = život, opsis = gledanje. l 24/02/2021 alen vukelić, dr 5

l Kliničari govore o biopsiji kao o određenom operativnom zahvatu i to uglavnom u histološke svrhe. l Definicija : Biopsija je medicinska analiza oboljelog tjelesnog organa na temelju uzorka izrezanog iz živog organizma. 24/02/2021 alen vukelić, dr 6

l Možemo reći da je biopsija specijalni dijagnostički pregled komadića živoga tkiva koji se izvodi u svrhu utvrđivanja njegove građe, sastava i naravi. 24/02/2021 alen vukelić, dr 7

Vrste biopsija l Bioptička punkcija Bioptička aspiracija Probatorna ekscizija l Sternalna ili zdjelična punkcija l l 24/02/2021 alen vukelić, dr 8

Izvedba biopsije l l Biopsija se vrši kao i svaki drugi operativni zahvat pod najstrožim mjerama asepse u lokalnoj ili općoj anesteziji. Za bioptički pregled uzima se komadić tkiva ili iz sredine ili iz mjesta gdje su uočene promjene. 24/02/2021 alen vukelić, dr 9

l Dobiveni komadić tkiva uroni se sterilno u alkohol ili formalin, da se sačuva i da nepromijenjen dođe na histološku obradu. 24/02/2021 alen vukelić, dr 10

Fiksacija l Je postupak kojim se nastoji očuvati struktura tkiva, morfološke značajke i lokalizacija kemijskih tvari u stanju kakvo je bilo “in vivo” l Fiksacija sprečava nekrozu stanice, odnosno autolizu i djelovanje mikroorganizama 24/02/2021 alen vukelić, dr 11

l l Autoliza je proces autodigestije ili “samoprobave”stanice uslijed djelovanja enzima. To su lizosomski enzimi – hidrolaze, koji se oslobađaju nakon pucanja membrane lizosoma 24/02/2021 alen vukelić, dr 12

l Fiksacija se može postići : 1. fizikalnim putem 2. kemijskim putem 24/02/2021 alen vukelić, dr 13

Fizikalna fiksacija tkiva Ne upotrebljava se često. . . To može biti toplina, kao suha pri sušenju preparata Može biti hladnoća, koja sprečava autodigestiju i nekrozu, ali i oštećuje tkivo stvaranjem kristala i volumnim povećanjem vode. 24/02/2021 alen vukelić, dr 14

Kemijska fiksacija tkiva l Najviše se koristi. . . l To su najčešće : pikrinska , octena i kromna kiselina , metalne soli , bikromati , sublimat , alkohol i formaldehid. 24/02/2021 alen vukelić, dr 15

Fisacijom postižemo : l Brzu smrt stanice, da se struktura ne promijeni l Osigurava se mofologija stanice l Priprema se objekt za bojanje 24/02/2021 alen vukelić, dr 16

l Fiksativ mora sačuvati unutarnju strukturu , osobito bjelančevine. l SOL – stanje prelazi u ireverzibilno GEL – stanje, ali tako da po mogućnosti poredak koloidnih čestica ostane nepromijenjen. 24/02/2021 alen vukelić, dr 17

Dobar fiksativ mora : l l l Imati prodornu snagu Djelovati kao dezinficijens Postići da materijal otvrdne Očuvati tkivu afinitet za boje Proizvesti što manje artefakata 24/02/2021 alen vukelić, dr 18

l Fiksacija je proces pri kojem se zbivaju fine kemijske reakcije u tkivu i o tome ovisi kvaliteta histološkog preparata. . . l To može uvelike utjecati na očitavanje histološke slike , a onda i same dijagnoze za pacijenta. 24/02/2021 alen vukelić, dr 19

l Fiksacija se vrši na temperaturi hladnjaka +4 C l Transport materijala od mjesta uzimanja do laboratorija vrši se u termos bocama s ledom. 24/02/2021 alen vukelić, dr 20

24/02/2021 alen vukelić, dr 21

HISTOLOŠKE TEHNIKE 24/02/2021 alen vukelić, dr 22

l Prije uzimanja materijala moramo izabrati fiksativ, a izbor ovisi o vrsti histološke pretrage i o “prirodi” tkiva. l Izbor fiksativa je velik. . . 24/02/2021 alen vukelić, dr 23

l Najčešće je u uporabi – formalin i to kao 10% otopina l To je jednostavan i jeftin fiksativ l Ovo razrijeđenje(10%) dobije se tako da se 1 dio koncentriranog 35 -40%tnog formalina razrijedi s 4 dijela obične vode 24/02/2021 alen vukelić, dr 24

Za složenije postupke upotrebljavaju se mješavine različitih kemikalija l Za histokemijska istraživanja , za masne supstance , upotrebljavaju se fiksativi s vodom. . . l Histokemija istražuje kemiju živih bića na razini mikroskopske struktura l 24/02/2021 alen vukelić, dr 25

l l l Za histokemijska istraživanja, za ugljikohidrate upotrebljavamo fiksative bez vode Za određivanje nuklearnog spola koristi se fiksativ po Barr-u Finija citohistološka i histokemijska istraživanja zahtijevaju mješavine s pikrinskom kiselinom, sublimatom i kloroformom 24/02/2021 alen vukelić, dr 26

l Imunohistokemijska tehnika omogucava lokalizaciju specificnih antigena u tkivu ili u stanicama zasnovanu na prepoznavanju antigena i protutijela i omogucava vizualizaciju tog kompleksa na mikroskopskoj razini. 24/02/2021 alen vukelić, dr 27

24/02/2021 alen vukelić, dr 28

l Metode molekulske genetike omogućavaju dokazivanje gena metodom in situ hibridizacije odredene genske probe s kompatibilnim genom na histološkom preparatu i mikroskopsku vizualizaciju reakcije u stanicnoj jezgri 24/02/2021 alen vukelić, dr 29

SMRZAVANJE TKIVA Svako se tkivo ne može fiksirati kemijskim sredstvima, pa da bi se moglo rezati mora se SMRZNUTI l l l Temperatura smrzavanja ovisi o vrsti tkiva. Smrznuti rezovi puno su osjetljiviji i oni traju samo par mjeseci dok parafinski traju godinama. Preparat se gleda pod mikroskopom. 24/02/2021 alen vukelić, dr 30

Smrznuti rez l l Intraoperacijska dijagnostika, kao i histokemija enzima i lipida, zahtjeva preparate izrezane iz svježeg tkiva. U tu svrhu rabi se stroj kriostat. U zatvorenoj komori kriostata automatski seodržava niska temperatura (-20°C). Za par sekundi blok svježeg tkiva smrzne se na istu temperaturu i jednako ohladenim mikrotomskim nožem narežu preparati debljine 10 mikrometara. 24/02/2021 alen vukelić, dr 31

– 195, 8 24/02/2021 alen vukelić, dr 32

l Tekući dušik najčešće je korišteni agens. Temperatura mu je – 195, 80 C, a dostupan je kod proizvođača tehničkih plinova, u posebnim metalnim kontejnerima u kojima se može čuvati dva do tri mjeseca. Prije korištenja, tekući dušik ulijeva se u običnu termos bocu u kojoj se može održati cijelog radnog dana. 24/02/2021 alen vukelić, dr 33

24/02/2021 alen vukelić, dr 34

l l l Tkivo se znatno ošteti sporijim smrzavanjem je nastaju ledeni kristali koji oštecuju stanice Nagomilavaju se citoplazmatske strukture i pucaju mitohondriji. Izrezane preparate treba fiksirati u 95% alkoholu. Mogu se cuvati u hladnjaku na +4 °C mjesec dana, ili više mjeseci u tekucem dušiku. 24/02/2021 alen vukelić, dr 35

24/02/2021 alen vukelić, dr 36

l l Osobito je delikatan postupak uzimanja i fiksiranja objekata za elektronsku mikroskopiju. Objekt se neposredno nakon uzimanja stavlja u prefiksativ, pa zatim u fiksativ. Materijal mora biti vrlo malen (glava šibice) Nakon natapanja u prefiksativu izreže se još na manje komadiće 24/02/2021 alen vukelić, dr 37

24/02/2021 alen vukelić, dr 38

ISPIRANJE TKIVA l Nakon fiksacije kemijskim sredstvima, vrši se ispiranje tkiva vodom. Ispiranje vodovodnom vodom. 24/02/2021 alen vukelić, dr 39

HISTOKINET l Nakon ispiranja vodom, tkivo se unosi u Histokinet. l Histokinet je aparat u kojem se vrši DEHIDRATACIJA i BISTRENJE TKIVA. 24/02/2021 alen vukelić, dr 40

24/02/2021 alen vukelić, dr 41

24/02/2021 alen vukelić, dr 42

DEHIDRATACIJA TKIVA - tkivo se dehidratizira u alkoholima rastućih koncentracija l BISTRENJE TKIVA - proces dealkoholiziranja tkiva - vrši se u ksilolu l 24/02/2021 alen vukelić, dr 43

UKLAPANJE (PROŽIMANJE) TKIVA l l l Nakon bistrenja tkivo se stavlja u parafinsku peć (23°C / 2 h). Iz parafinske peći tkivo se uklapa u čisti parafin. Nastaju parafinski blokovi. 24/02/2021 alen vukelić, dr 44

parafinska peć 24/02/2021 alen vukelić, dr 45

24/02/2021 alen vukelić, dr 46

REZANJE TKIVA l l l Parafinski blok za rezanje mora biti ohlađen na -20° C. Rezanje tkiva vrši se aparatom koji se zove MIKROTOM. Reže se na debljinu od 2 mikrometra. Pomoću kistova rez položimo na površinu vode u kupelji i tamo se preparat ispegla. Ispeglan preparat stavlja se na predmetno stakalce koje je obrađeno SILANOM. 24/02/2021 alen vukelić, dr 47

24/02/2021 alen vukelić, dr 48

Rezanje l 24/02/2021 alen vukelić, dr 49

l Rezovi se pohranjuju u posebne kutije i mogu trajati godinama. 24/02/2021 alen vukelić, dr 50

BOJANJE PREPARATA Postoje raznovrsna bojanja tkiva (blokova ili rezova): 1. )Vitalno bojanje 2. ) Rutinsko, standardno bojanje (npr. Hemalaun. Eozin bojanje) 3. ) Specijalno bojanje 4. ) Histokemijske reakcije 5. ) Metakromatsko bojanje 6. ) Impregnacija 24/02/2021 alen vukelić, dr 51

MONTIRANJE PREPARATA Za montiranje preparata koristi se ENTELAN koji se stavlja između predmetnice, reza i pokrovnice. 24/02/2021 alen vukelić, dr 52

MIKROSKOPIRANJE PREPARATA Fiksirane i obojane stanice proučavaju se svjetlosnim mikroskopom. Žive stanice mogu se proučavati uz pomoć mikroskopa s faznim kontrastom. Elektronska obrada slike omogućuje preciznu interpretaciju slike. 24/02/2021 alen vukelić, dr 53