High Speed Counter Current Chromatography HSCCC a b

一 高速逆流色谱技术简介 高速逆流色谱(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC) a 多层盘绕管；b 平衡物

表 1 最佳溶剂体系选择表 极性较弱溶剂 最佳溶剂 极性较强溶剂 heptane, CHCl 3 THF H 2 O heptane, toluene, Mi. BK, CHCl 3, Et. OAc ACO H 2 O heptane methyl ketone H 2 O THF DMSO H 2 O toluene, Mt. BE, Mi. BK, Et. OAc Me. CN H 2 O heptane, toluene, CHCl 3, Et. OAc Bu. OH H 2 O heptane, toluene, CHCl 3, Et. OAc Pr. OH H 2 O heptane, CHCl 3, Et. OAc Et. OH H 2 O heptane, toluene, CHCl 3, Et. OAc, Bu. OH Me. OH H 2 O heptane, toluene, CHCl 3, Mi. BK, Et. OAc, Bu. OH HOAc H 2 O CHCl 3 HCOOH H 2 O 非水体系 Heptane THF, DMF, Et. OAc, Pr. OH, Et. OH Me. OH, Me. CN

逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图 Type 1: Chloroform / Methanol / Water 应用：杆菌肽，Niphimycin，克念菌素 ，Herbicidins A, B等

Type 2. Ethyl acetate / butanol / Water l 应用：WAP-8294 A ，弱极性样品 l

Type 0: Water /Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 应用：极性强的难溶性样品如两性霉素B

CPC separation of Amphotericin B(peak 7) Water-DMSO-THF(24. 6: 16. 2: 59. 2, V/V/V)

实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分离 Sporaviridins A 1 R 1 H R 2 OH R 3 C 2 H 5 A 2 H OH CH 3 B 1 B 2 C 1 H H OH NH 2 OH C 2 H 5 CH 3 C 2 H 5 C 2 OH OH CH 3

HPLC separation of sporaviridins. Column: Cosmosil 5 C 18 (5 um, 150 mm*4. 6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium chloride (74: 26, v/v), flow rate: 1 ml/min, detection: 232 nm.

孢绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数 —————————————— 分配系数（U/L） 正丁醇/乙醚/水 ————————— C 2 B 2 A 2 C 1 B 1 A 1 ————————————— 10: 0: 10 2. 96 6. 41 6. 65 4. 87 8. 81 9. 09 10: 3: 10 0. 96 2. 17 2. 78 1. 84 3. 34 4. 19 10: 4: 10 0. 50 1. 12 1. 59 1. 04 1. 85 2. 91 10: 5: 10 0. 38 0. 78 1. 11 0. 74 1. 25 2. 12 10: 6: 10 0. 39 0. 90 1. 19 0. 81 1. 39 1. 70 10: 7: 10 0. 24 0. 63 1. 10 0. 59 1. 08 1. 82 10: 4: 11 0. 31 0. 89 1. 24 0. 70 1. 50 2. 00 10: 4: 12 0. 38 1. 09 1. 41 0. 80 1. 85 2. 32 10: 4: 13 0. 37 1. 05 1. 51 0. 73 1. 58 2. 10 10: 4: 14 0. 29 1. 09 1. 17 0. 57 1. 22 1. 74

l HPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5 C 18 (5 um, 150 mm*4. 6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium choride (74: 26, v/v), folw rate: 1 ml/min, detection: 232 nm.

三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例 文献报道： 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 肽类 短杆菌肽A, B, C C 6 H 6 -CHCl 3 -Me. OH-H 2 O LP 多粘菌素 n-Bu. OH-0. 04 MTFA(1%glycerol) LP 杆菌肽 CHCl 3 -Me. OH-H 2 O LP CHCl 3 -Et. OH-Me. OH-H 2 O LP WAP-8294 A n-Bu. OH-Et. OAC-0. 005 M TFA LP 1982 1991 2001 放线菌素类 放线菌素混合物 Et 2 O-n. C 6 H 14 -Me. OH-H 2 O 1986 UP

样品 大环内酯类 2 -去甲基红霉素 溶剂系统 流动相 n. C 5 H 12 -C 6 H 6 -Ac. O-i. Pr. OH -0. 01 M citrate buffer(p. H 6. 3) UP 尼达霉素 CCl 4 -Me. OH-0. 01 MK 3 PO 4 buffer(p. H 7) UP Tiacumicins CCl 4 -CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP Coloradocin CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP 孢绿菌素 n-Bu. OH-Et 2 O- H 2 O LP 霉菌素 n-C 6 H 14 -Et. OAc-Me. OH-8%NH 3. H 2 O LP Dunaimycin n-C 6 H 14 -Et. OAc-Me. OH-H 2 O UP 原始霉素 CHCl 3 - Et. OAc-Me. OH-H 2 O UP 伊维菌素 n-C 6 H 14 -Et. OAc-Me. OH-H 2 O LP 螺旋霉素 n-C 6 H 14 -Et. OAc-Me. OH-H 2 O UP 发表时间 1988 1990 1991 1992 1996 2000

样品 流动相 发表时间 蒽环类 道诺红霉素衍生物 CHCl 3 -CH 2 Cl 2 -n. C 6 H 14 Me. OH-H 2 O UP Benzanthrins A, B CCl 4 -CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP Tetracenomycin D Et. OAC-C 6 H 12 -Me. OH-H 2 O UP 1981 1986 2005 多烯类 呋罗托霉素 克念菌素 溶剂系统 CCl 4 -CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP UP 头孢类 Cephalosporin C & PEG 600 15%W/W-(NH 4)2 SO 4 Desacetyl Cephalosporin C 17. 5%W/W LP 1985 1987 1995

样品 其它 Pentalenolactone 溶剂系统 CHCl 3 -Me. OH-H 2 O 流动相 UP （内酯） Tirandamycin A, B n-C 6 H 14 -Et. OAc-Me. OH-H 2 O UP Siderochelin A CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP A 201 E CCl 4 -CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP Bu 2313 B n-C 6 H 14 -CH 2 Cl 2 - Me. OH-H 2 O LP Sordarin derivative CH 2 Cl 2 -CF 3 COOH(0. 04%) UP SCH 42282 CHCl 3 -Me. OH-H 2 O UP (含糖大环内酰胺) 发表时间 1985 1985 2004 1998

我们的 作 1. HSCCC分离海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物 HSCCC分离前粗品FW 635 HPLC图 HSCCC: 仪器：同田生物TBE-300 CHCl 3: CH 3 OH: H 2 O(4: 3: 2, V/V/V) Mobile Phase: LP，转速 800 rpm

FW 635 I – 1 t 1 10. 75 min FW 635 I- 2 t 2 11. 35 min

分离后 Ac 1 HPLC图 Ac 2 HPLC图

Cyclosporin C 10. 816 min Cyclosporin B 11. 915 min Cyclosporin A 13. 493 min Cyclosporin D 16. 043 min

异构体 1分离的溶剂系统选择(石油醚/丙酮/水） 溶剂比例 a上(峰面积 a下(峰面积 b上(峰面积 b下(峰面积 K 1(a上/ a下) K 2(b上/ b下) ) ) 3： 2： 2 2050105 2458306 3946083 3813162 0. 83 1. 03 3： 3： 2 3046107 7112647 2558036 3682147 0. 43 0. 69 3： 4： 2 3301481 13373343 1856063 6498237 0. 25 0. 29 HSCCC分离 石油醚/丙酮/水=3: 3: 2, 流动相：LP 固定相保留率： 76%; 流速： 1. 5 ml/min; 转速: 900 rpm; =K 2：K 1 = 0. 69/0. 43=1. 60

异构体 2分离的溶剂系统选择(石油醚/甲醇/丙酮/水） 溶剂比例 a上(峰面积) a下(峰面积 b上(峰面积 ) ) b下(峰面积) K 1(a上/ a下) K 2(b上/ b下) 3： 0. 5： 3： 2 12380407 21720021 6238221 18903698 0. 57 0. 33 3： 1. 0： 3： 2 8806888 13836092 5186370 5242380 0. 66 0. 99 3： 1. 5： 3： 2 11353025 13614393 6416402 4996450 0. 83 1. 28 HSCCC分离 石油醚/甲醇/丙酮/水= 3： 1. 5： 3： 2, 流动相：LP 固定相保留率： 83%; 流速： 2. 0 ml/min; 转速: 900 rpm; = K 2/K 1=1. 28/0. 83=1. 54