Herbisitlere Otldrclere Toleransl Transgenik Bitkilerin Elde Edilmesi Sebahattin

Herbisitlere (Otöldürücülere) Toleranslı Transgenik Bitkilerin Elde Edilmesi Sebahattin ÖZCAN

Yabancı otlar: tarım alanlarında bulunan ve yarardan çok zarar veren . bütün bitkiler olarak tanımlanabilir Dünya bazında yabancı ot ve hastalık etmenlerinin oluşturduğu kayıplar (milyon ton) Yabancı Ot Ürün Çeşidi Elde Edilen Kayıpları Ürün Hastalık Kayıpları Hububat 433. 903 54. 349 50. 589 Sebzeler 201. 691 23. 718 31. 137 Meyveler 66. 567 2. 462 12. 825 50. 697 7. 909 16. 937 Bağlar Özer 1993, Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

Yabancı ot mücadelesinde kullanılan başlıca yöntemler l l Mekanik savaş yöntemleri: çapalama, elle yolma, toprak işleme ve su altında bırakma, Fiziksel savaş yöntemleri: ısı ve ışınlardan yaralanma, Biyolojik savaş yöntemleri: bir canlı populasyonunu; böcekler, balıklar, mantarlar ve bakteriler gibi diğer canlı organizmalar aracılığı ile azaltmak için kullanılan yöntemler, Kimyasal savaş yöntemleri: sentetik veya doğal yabancı ot öldürücüler (herbisitler) kullanılarak yürütülen mücadele yöntemleri.

Herbisitlerde bulunması gereken özellikler l l Geniş bir yabancı ot populasyonuna karşı etkin olmalı, Kültür bitkisine, memelilere ve omurgasız canlılara karşı toksik etki göstermemeli, Toprakta kalıcılığı kısa olmalı, Üretim maliyeti düşük olmalı.

Herbisitler l l Herbisitler, nihai hedefi olan bitkiye zarar verdiklerinden dolayı, bitki üzerinden beslenen ve barınan tüm canlıları olumsuz etkilemektedir. Bu sebeple; herbisitler, kullanılan pestisitler içerisinde doğaya en fazla zarar veren grup olarak nitelendirilmektedir. Ancak, çoğu insektisit insan ve hayvanlar için toksik olmalarına karşın herbisitler bu organizmalar üzerinde toksik etki yapmamaktadır. Herbisitler genellikle bitkilere özgün, örneğin fotosentez aktivitesi gibi, biyokimyasal yolları etkilemektedir. Bunun dışında değişik etki mekanizmaları olan farklı grup herbisitler mevcuttur.

Herbisitlerin etken maddeleri ve etki sistemleri. Etkili Madde Etkilediği Sistem Hedef Protein Sulfonilurea Alifatik amino asit sentezi Asetolaktat sentaz seçici Imidazolinon Alifatik amino asit sentezi Asetolaktat sentaz seçici Glifosat Aromatik amino asit sentezi 5 -enolpurivil-shikimate-3 fosfat sentaz (EPSPS) total Phosfinotrisin (PPT) Glutamin sentezi Glutamin sentaz total Triazin Fotosentez (fotosistem-II) Q proteini total Bromoxinil Fotosentez (fotosistem-II) Q proteini total Bipiridiliumlar (paraquat) Fotosentez (fotosistem-I) Ferrodoksin total Ariloksifenoksipropionat Lipid sentezi Asetil coenzim-A karboksilaz (ACCase) seçici Fenoksiasetik asitler (2, 4 -D) ? ? seçici Dinitroanilinler Hücre bölünmesi Tübilin seçici Bipiridilumlar, paraquat, diquat Fotosentez (fotosistem-I) Elektron transfer sistemi total SPEKTRUM Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

Herbisite Dayanıklı Transgenik Bitki Elde Edilmesi Özer 1993, Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

Herbisite Dayanıklı Bitki Elde Edilmesi l Hedef molekülün modifikasyonu (hedef molekülün aktif maddeden korunmasını sağlar) l Hedef molekülün fazla üretimi (hedef molekülün aktif maddeden korunmasını sağlar) l Etken maddenin detoksifikasyonu (aktif maddenin farklı bir bileşiğe çevrilerek etkenliğinin ortadan kaldırılması sağlanır).

1. Hedef molekülün modifikasyonu l l Bu stratejide; herbisitin aktif maddesinin hedef aldığı proteinin modifikasyonu, başka bir deyişle proteinin aktif maddeye duyarsız hale getirmesi amaçlanmaktadır. Sonuç olarak, kültür bitkilerine normal hücresel fonksiyonunu yerine getirebilen, ancak herbisitin aktif maddesince etkilenmeyen yeni bir protein sentezlettirilmektedir. Bu sayede, herbisitin varlığında kültür bitkisi yaşamını sürdürebilmektedir. Bu konuda yürütülen çalışmalarda iki değişik yaklaşım gözlenmektedir.

Hedef molekülün modifikasyonu 1. Yaklaşım Hedef genin kültür bitkisinden izolasyonu l Hedef genin manipülasyonu l Manüplasyonu yapılan genin, gen aktarım vektörlerine klonlanması l Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı l Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi l

Hedef molekülün modifikasyonu 2. Yaklaşım l l l Herbisite dayanıklı organizmanın (bakteri veya diğer bitki) belirlenmesi Hedef genin bu organizmadan izolasyonu Hedef genin gen aktarım vektörlerine klonlanması Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi

Hedef molekülün modifikasyonu; Örnekler l l l Triazine dayanıklı yabancı otlardan ve syanobakteriden izole edilen psb. A geni tütüne aktarılarak atrazine dayanıklı transgenik bitkiler elde edilmiştir Salmonella typhimurium’dan izole edilen mutant bir aro. A geni tütün, domates ve karaçama aktarılarak glifosata dayanıklı bitkiler elde edilmiştir Memelilerde ilaçları metabolize eden P 450 monooksigenaz enziminin sentezinden sorumlu genin tütüne aktarılması ile herbisite dayanıklılık kazandırılmasıdır

2. Hedef molekülün fazla üretimi l l l Bu stratejide, bitiklerdeki hedef molekül bazı genetik manipülasyonlar sonucu daha fazla üretilmekte, böylece herbisit aktif maddesinin varlığında bile hedef molekülün sorumlu olduğu hücresel fonksiyonlar yerine getirilebilmektedir. Bu yönde petunya üzerinde yapılan çalışmalarda 5 -enolpurivil-shikimate-3 -fosfat sentaz (EPSPS) aktivitesi 20 kez arttırılarak glifosata tolerans sağlanmıştır. Kolzada glutamin sentetaz enziminin fazla sentezlettirilmesi sonucunda fosfinotrisin (PPT)’ne dayanıklı bitkiler elde edilmiştir.

3. Etken maddenin detoksifikasyonu l l Bu stratejide, bitkiye herbisitin aktif maddesini detoksifiye eden yeni bir enzim sentezlettirilmektedir. Bu amaçla, detoksifikasyon yapan enzimin sentezinden sorumlu gen bitkilere aktarılmakta, bu sayede de herbisitin aktif maddesi hedef molekülü etkileyemeyen bir bileşiğe çevrilmekte, dolayısıyla hedef molekül de herbisitin varlığında bile normal hücresel işlevini yürütebilmektedir. Bu konuda yapılan çalışmalar sonucunda, bitkilere 2 -4, D detoksifikasyonunu mümkün kılan bakteri orijinli monooksigenaz enzimi sentezlettirilerek bu herbisite dayanıklı bitkiler. geliştirilmiştir. Yine, fosfinotrisin (PPT)’in detoksifikasyonunu sağlamak amacıyla bakteri orijinli bar ve pat genleri bitkilere aktarılarak bialafos ve/veya glufosinat amonyuma dayanıklı transgenik bitkiler geliştirilmiş olup, tarla denemelerinde de bu bitkilerin yüksek dozda herbisite dayanıklılık gösterdikleri saptanmıştır.

Glutamin Sentetaz İnhibitörleri l l l l Gram pozitif toprak bakterileri olan Streptomyces hygroscopicus ve Streptomyces viridochromogenes suşları fosfonotrisil-alanin yapısında bir tripeptid üretmektedirler. Bakteriler tarafından üretilen bu bileşik Bialafos olarak adlandırılan bir antibiyotiktir. Bialaphos’un hücre içerisinde peptidaz aktivitesi ile hidrolizi sonucu ortaya çıkan fosfinotrisin (PPT), glutamino asidinin bir analoğu olup, amino asit biyosentzinde rol alan glutamin sentetaz (GS) enziminin rakip inhibitorüdür. PPT bakteri, bitki ve hayvan hücrelerinde GS enzimlerini inhibe edebilmekte ve bu özelliğinden dolayı kontak etkili total bir herbisit olarak da kullanılmaktadır. PPT herbisit olarak iki değişik ticari şekilde pazara sunulmaktadır. Alman Hoechst firması PPT’nin amonyum tuzu olan glufosinat amonyumu (ammonium-DL-homoanalin-4 -yl(methyl)phosphinate) kimyasal olarak sentezlemekte ve BASTA ticari adı altında pazara sürmektedir. Herbisitin diğer ticari şekli ise Japon Meiji Seika firması tarfından Herbiace ticari ismi altında piyasaya sürülmektedir. Bu preperatta bialafos Streptomyces hygroscopicus suşlarından fermantasyon yoluyla elde edilmektedir.

PPT etki mekanizması l l l l Bir önceki bölümde de kısaca açıklandığı gibi, PPT amino asit biyosentezinde önemli rolü olan glutamin sentetaz enzimini inhibe etmektedir. GS enzimi (E. C. 6. 3. 1. 1. ), glutamik asit ile amonyumun tepkimeye girerek glutamini oluşturduğu tepkimeyi katalizleyen enzimdir. Glutamik asit + NH 4+ + ATP Glutamin + ADP + Pi + H+ Bitkilerde GS enzimi, nitratın indirgenmesi, amino asit degredasyonu ve fotorespirasyon sonucu ortaya çıkan NH 4+’un asimilasyonunu sağlayan tek enzimdir. GS aktivitesi durduğunda hücrelerde NH 4+ birikimi gözlenmekte ve bu da hücrelerde dolayısıyla bitkiler üzerinde kısa sürede ölümcül etki yapmaktadır. PPT, daha önce de açıklandığı gibi GS enziminin rakip inhibitörü olup, bu özelliği sayesinde kontakt etkili total herbisit olarak kullanılabilmektedir. PPT bitkilerde olduğu kadar bakteri ve hayvan hücrelerinde de GS aktivitesini inhibe edebilmektedir. Ancak, hayvanlarda kan-beyin engelini (blood-brain barier) aşamaması ve böbrekler yoluyla kısa sürede temizlenmesi bu organizmalar üstünde toksik etki yapmamasını sağlamaktadır. Ayrıca, PPT toprak bakterileri tarafından metabolize edilebildiğinden çevrede oluşturabilceği toksik etkiler minimal seviyede kalmaktadır.

PPT’ye dayanıklı transgenik bitkilerin geliştirilmesi l l l PPT’in hayvanlar üzerindeki düşük toksisitesi ve topraktaki ömrünün kısa olması, yabancı ot mücadelesinde yaygın olarak kullanılabilirliliğini gündeme getirmektedir. Ancak, PPT’in kontakt etkili total herbisit olması, başka bir deyişle seçiciliğinin olmaması yaygın olarak kullanımını engelleyen en büyük faktördür. Bu nedenden dolayı da PPT’ye dayanıklılık gösteren kültür bitkilerinin geliştirilmesi yönünde birçok çalışma bulunmaktadır. Bu yönde yapılan çalışmalarda başlıca iki strateji kullanılmıştır. Bunlardan ilki önceki bölümlerde detaylı olarak açıklanan GS enziminin miktarının arttırılması yönündeki çalışmalardır. İkinci ve daha yaygın olarak gözlenen yaklaşım ise PPT’in hücre içerisindeki detoksifikasyonunun sağlanmasıdır.

PPT’yi detoksifiye edebilen enzimler l l l Bialafos, Streptomyces hygroscopicus ve Streptomyces viridochromogenes suşları tarafından üretilmektedir. Biyosentezin 10. kademesindeki enzim, hem biyosentezin devamını sağlamakta hem de PPT’i asetilasyon yoluyla etkisiz hale getirmektedir. Başka bir deyişle, bu suşlar kendilerini ürettikleri antibiyotiğin öldürücü etkisinden korunmak amacıyla PPT detoksifiasyonunu mümkün kılan fosfinotrisin-N-asetiltransferaz (PAT) enzimini sentezlemektedirler. PAT enziminin sentezinden sorumlu olan bar ve pat genleri sırası ile S. hygroscopicus ve S. Viridochromogenes suşlarından izole edilmişlerdir. Her iki genin ürünü olan enzimler saflaştırılarak karakterize edilmiştir. Buna ek olarak, her iki proteinin sindirim sistemi enzimleri tarafından parçalanabildiği ve deneklerde herhangi bir alerjik etki yapmadıkları da bildirilmiştir.

Bar ve pat genlerinin bitkilere aktarımı l l Birçok laboratuvar, bar veya pat genini kullanarak değişik bitki türlerinde PPT’e dayanıklı bitkiler geliştirmeyi başarmışlardır. Bu çalışmalarda hedef bitkilere bar geni aktarılmakta ve üretilen transgenik çeşitler PPT’i dektoksifiye eden BAR enzimini sentezlediklerinden dolayı herbisite maruz kaldıklarında PPT’den etkilenmemektedirler.

Bar geni taşıyan transgenik kolza bitkileri Kontrol kolza bitkileri Salamini ve Moto 1994, Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

+Bar +Pat Kontrol BASTA herbisit uygulaması Hall vd. 1996, Öktem 2002 (Ed: Özcan vd. )

Herbisitlere Toleranslı Transgenik Bitkilerin Potansiyel Avantajları l l l Geniş spektrumlu kontakt ve sistemik herbisitlerin kullanımı toprak işlemeyi azaltabilir. Toprak işlemenin azaltılması sayesinde toprak mikroflora ve faunası korunmuş olur. Ayrıca, erozyon azaltılır. “Glyphosate” ve “glofusinate ammonium” yabacı ot tohumları çimledikten sonra kullanılabilmekte ve çok kısa süre aktif kalmaktadır. Bu ise, “atrazine” gibi ürünün ekiminden önce kullanılan ve toprakta etkisini uzun süre muhafaza eden herbisitlerin kullanımını engelleyebilir. Herbisitlerin kullanımında azalma sağlanabilir.

Herbisitlere Toleranslı Transgenik Bitkilerin Potansiyel Dezavantajları l l l Geniş sepektrumlu herbisitlerin kullanımı sonucunda kuşlar, toprak solucanları ve faydalı böcekler için önemli bir besin kaynağı olan kültür bitkilerinin içerisindeki tüm yabacı otlar yok edilmektedir. Kullanılacak olan geniş spektrumlu herbisitler çok etkili olduğundan dolayı, bunların yabani hayata etkileri de o derece fazla olacağı düşünülmektedir. Dikkatli olunmadığı takdirde yabancı döllenen türler içerisinde gen geçişi olabilecektir. Ekim nöbetinde, bu tür bitkilerin tohumları ertesi yıl çimlendiği takdirde yok edilmeleri zorlaşabilecektir.