Hematopoietic StemProgenitor Cells CFC Assays Immunophenotype C CarloStella

Hematopoietic Stem/Progenitor Cells CFC Assays & Immunophenotype C. Carlo-Stella, M. D. “Cristina Gandini” Medical Oncology Unit Istituto Nazionale Tumori and University of Milano, Italy

Hematopoietic Stem Cells • Regulate the production, maintenance and regeneration of the many different myelolymphoid blood cell types throughout life span • HSCs are regulated by cell-autonomus and cell-nonautonomous mechanisms quantitative matter: in humans, HSCs produce 70 kg of cells per year

Stem and Progenitor Cells HSC CMP CLP MEP GMP T B Mo Gr Me Er

Clonal Origin of Hematopoiesis SPLEEN COLONY Till and Mc. Culloch, Radiat Res 1961 • SELF-RENEWAL • DIFFERENTIATION • PROLIFERATION Spleen colony assay = the first quantitative test for stem cells

Hematopoietic Progenitor Cells

Heterogeneity of Human HSCs

Cell Surface Markers of HSCs • • • CD 34+ CD 133+ Thy 1+ CD 38 CD 117 Lin- • None of the markers are tied to unique stem cell functions or truly define the stem cell

CD 34+ Cells

Analisi dei Progenitori Emopoietici Protocollo ISHAGE • Absolute cell count • Single platform • Lyse-no wash

ABSOLUTE CELL COUNTS Parameter 2 A KNOWN NUMBER OF FLUORESCENT MICROBEADS IS ADDED TO AN UNKNOWN NUMBER OF CELLS IN A KNOWN STARTING BLOOD VOLUME GATE 1 (Cells) GATE 2 (Beads) Parameter 1 N°of CELL Events (Gate 1) N°of BEAD Events (Gate 2) BLOOD CELLS AND BEADS EVENTS ARE ACQUIRED SIMULTANEOUSLY, AND THEIR RESPECTIVE REGIONS ARE IDENTIFIED. THE ABSOLUTE CELL NUMBER IS CALCULATED ACCORDING TO THE Following FORMULA: ABSOLUTE N° of BEADS per X Unit of Volume = CELL COUNT

Preparazione del Campione (1) RACCOLTA del CAMPIONE • • Il sangue periferico deve essere raccolto in provette con EDTA I campioni di Leucaferesi vengono raccolti utilizzando ACD come anticoagulante Il campione deve essere mantenuto a temperatura ambiente prima della colorazione Possibilmente la colorazione deve avvenire entro 12 ore dalla raccolta

Preparazione del Campione (2) MATERIALI e REAGENTI § § § CD 45 FITC e CD 34 PE Cloruro di Ammonio PBS (p. H 7, 2 + 0, 1% sodiazide) con 2% FBS 7 Amino Actinomicina D (7 -AAD) per valutazione vitalità Provette BD Tru. Count™

Conta delle Cellule CD 34+ con Provette TRUCOUNT™ ALLESTIRE IL CAMPIONE IN DUPLICATO 20 µL CD 45 FITC/CD 34 PE +20 µL 7 -AAD + 100 µL Sangue Diluire il SANGUE PERIFERICO o la LEUCAFERESI < 20, 000 WBC/µL VORTEX Incubazione a +4°C al buio 20 minuti 2 ml Cloruro di Ammonio LISI Incubazione T. A. al buio 10 -15 minuti Acquisire entro un’ora dalla lisi

“Thresold” per eliminare detrit “Thresold” su FSC scomparsa delle BEADS ! “Thresold” su FL 1

Selezione delle Tru. Count “beads” Attenzione alla eventuale interferenza fra Tru. Count ed eventi CD 34+

Acquisizione con Cell. QUEST sequenza della procedura detriti gate di pulizia

G 1 = R 1 and not R 6 G 2 = R 1 and R 2 G 3 = G 2 and R 3 CD 34+ = R 1 + R 2 + R 3 + R 4 NON R 6 e R 9 G 9 (cellule morte) = R 1 and R 9 and not R 6

CD 34 xxbeads in tube x 22 = = CD 34+/µL 125 50147 x 50 /µL Beads sangue 2507 100