Hematoloji Laboratuvarnda Standardizasyon Dr Oral NEVRUZ GATA Hematoloji

Hematoloji Laboratuvarında Standardizasyon Dr. Oral NEVRUZ GATA Hematoloji BD

Bir saatliğine mutlu olacaksanız, şekerleme yapın Bir günlüğüne mutlu olacaksanız, balık avlamaya gidin Bir aylığına mutlu olacaksanız, evlenin Bir yıllığına mutlu olacaksanız, bir servete konun Tüm yaşam boyunca mutlu olacaksanız, İŞİNİZİ SEVİN. . . ÇİN ATASÖZÜ 2

Standart Üretimde , anlayışta, ölçme ve deneyde bir örnekliktir. 4

Standardizasyon • Tesbit edilen bir iş ile ilgili olarak, ekonomik fayda sağlamak üzere bütün ilgili tarafların yardım ve işbirliği ile belirli kurallar koyma ve bu kuralları uygulama işlemidir 5

• Standardizasyon işlemi ile öncelikli olarak can ve mal güvenliği hedeflenirken aynı zamanda kalitenin alt sınırı tespit edilmek suretiyle belirlenen düzeyin altında mal ve hizmet üretimine müsaade edilmemektedir 6

Üretici için yararları • Üretimin belirli plan ve programlara göre yapılmasına yardımcı olur. • Uygun kalite ve seri imalâta imkân sağlar. • Kayıp ve artıkları asgariye indirir. • Verimliliği artırır. • Depolamayı ve taşımayı kolaylaştırır, stokların azalmasını sağlar. • Maliyeti düşürür. 7

Ulusal ekonomi için yararları • Kaliteyi teşvik eder, kalite seviyesi düşük üretimle meydana gelecek emek, zaman ve hammadde israfını ortadan kaldırır. • Sanayi belirli hedeflere yöneltir. Üretimde kalitenin gelişmesine yardımcı olur. • Ekonomide arz ve talebin dengelenmesinde yardımcı olur. • Yanlış anlamaları ve anlaşmazlıkları ortadan kaldırır. • İhracatta ve ithalatta üstünlük sağlar. • Yan sanayi dallarının kurulması ve gelişmesine yardımcı olur. • Rekabeti geliştirir. • Kötü malı piyasadan siler 8

Tüketici için yararları • • • Can ve mal güvenliğini sağlar. Karşılaştırma ve seçim kolaylığı sağlar. Fiyat ve kalite yönünden aldanmaları önler. Ucuzluğa yol açar. Tüketicinin bilinçlenmesinde etkili rol oynar. 9

Akreditasyon • Uluslararası kurallara uygun olarak günümüzde Akreditasyon; Yetkili bir kuruluşun, belli işleri yapan bir kuruluş veya kişinin yeterliliğinde resmi tanıklık etmesi işlemi olarak tanımlanmaktadır. 10

Akreditasyon • SOP’ lerini muntazam hazırlayan, internal ve extrenal kontrollerini zamanında tamamlayan hematoloji laboratuvarları kendilerini bir dönem sonra Akredite ettirmelidirler. 11

Akreditasyon • Akreditasyon laboratuvarın genel organizasyonunun external denetimi , idaresi , Kalite Kontrol Programı ve hasta-hekim memnuniyetine kadar çok geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. 12

Akreditasyon • Hastaya sonuç veren her hematoloji laboratuvarının akreditasyonu gerekir. • External peer-review sistemiyle laboratuvarın fonksiyonel kapasitesi, işleyisi ve veri eldesi ile analizleri etraflıca ve evrensel kriterlere gözden geçirilmelidir. 13

Akreditasyonda İşlem Akış şeması • • Bilgilenme başvurusu Gerekli formların ve bilgilerin temini Akreditasyon başvurusunun yapılması Akreditasyon Kurumunda dosyanın incelenmesi ve hakemlerin belirlenmesi Denetim ve Hakem Raporunun görüşülmesi Üst Kurul gözetimi, tartışması ve son kararın verilmesi Akreditasyon Sertifikası Sık Aralıklarla Laboratuvarın Denetimi ve gözetimi 14

Standard Operation Procedure (SOP) Formatı örneği • • • • Kapak Sayfası: Başlık –Referans numarası-Hazırlama Tarihi-isimler Kapsamı: Amacı –Testin temel prensibi- Görev alan personelin nitelikleri Örnekle ilgili Bilgiler Örnek Kabulu ve Reddi Kriterleri Guvenlik ve Korunma: Yuksek Riskli hastaların tanımı Cihazlar ve Reaktiflerin Özellikleri: Kontroller, kalibrasyon, vb. Uygulanan Testin etraflı tanımı Test Sonuclarının Raporlanması Test Sonuclarının Klinik Önemi Test Sonuclarının Sınırları ve Hata Payları Kan örneklerinin Saklanması ve atılması yöntemleri İlgili Literatur İmzalar 15

Avrupa Akreditasyon Kuruluşu (European Accreditation) Görevleri • • Test Uygulama ve Kalibrasyon Yerinde Denetim (Inspection) İşleyen Sistemlerin Sertifikasyonu (Certification of Management Systems) Ürünlerin Sertifikasyonu (Certification of Products ) Personelin Sertifikasyonu (Certification of Personnel) Cevre ve Ekoloji Konusunda Denetim ( European Eco-Management Rules) 16

Uygunluk • Gelişen teknoloji ile birlikte artış gösteren ürün çeşitliliği ve işlevselliği nedeniyle kalite, teknik emniyet, dayanıklılık ve kullanım gayesine uygunluk yönlerinden ürünlerden beklentilerin yerine getirilmesine dair artan güvence arayışlarına cevap teşkil etmek üzere ürün ve üretime yönelik belgelendirme, muayene, test ve analiz hizmetleri bugün uluslararası kuruluşlar tarafından Uygunluk Değerlendirmesi kavramı olarak tarif edilmektedir. 17

• Uluslararası kabul edilmiş ortak ölçütlere göre yapılandırılan ve çalıştırılan akreditasyon sistemleri uygunluk değerlendirilmesi farklı ülkelerde farklı niteliklerde yürütülmesinin engellenmesi, test ve belgelendirme konusunun ticarette teknik engel haline gelmesine yol açacak bir zemin oluşturmasının önüne geçilmesi amacıyla son on yıl içinde gelişen bir çözüm aracı olarak devreye girmiştir. 18

• Laboratuvarlarında hematoloji testleri yapan resmi veya özel kuruluşların sürekli profesyonel gelişim ve sürekli eğitim süreçleri içinde kendilerini yenilemeleri, laboratuvar standardizasyon tekniklerini uygulamaları ve eğitmeleri gerekmektedir 19

• ABD’de AACP ve İngiltere de Royal College of Pathologists bu ilkelerin takipçisi ve gereğinde yaptırımları olan otorite kuruluşlardır 20

• Adı geçen bu kuruluşlar hematoloji laboratuvarlarının teknik elemanlarına kurslar vermekte, yazılı ve görsel materyalleri takip etme imkanları sağlamakta ve bilgisayar aracılığı ile eğitim ve uygulama yapmaktadırlar. 21

• Bütün bu faaliyetlere katılan laboratuvarlar da bu kuruluşlar tarafından kredilendirmektedir. • Kuruluşların yeterli sayıda kredi toplayamadıkları durumlarda laboratuvar sertifikaları süreli olarak durdurulmaktadır. 22

Kemik İliği Aspirasyon Raporlanması Kurum adı Laboratuar kabul numarası Hasta kimlik bilgileri (ad, soyad, doğum, cinsiyet, kimlik no, telefon, hastane adresi) Sorumlu doktor adı Prosedür tarihi Önemli klinik bulgular, fizik muayene, kemo-radyoterapi, sitokin tedavisi) Kemik iliği aspirasyon endikasyonu Prosedür (aspirat, biyopsi ) Aspirasyonun anatomik lokalizasyonu Tam kan analizi ayrıntıları (CBC) Aspirasyonun kolaylık-zorluk derecesi Hücresel sellülarite Çekirdekli hücre diferansiasyon yüzdesi Total hücre sayısı Myeloid/eritroid oranı Eritropoesis Myelopoesis Megakryosit Lenfosit Plazam hücreleri Diğer hemopoetik hücreler Anormal hücreler (blast, metastatik infiltratlar) Demir boyama Sitokimyasal inceleme Diğer incelemeler Flow sitometre, PCR, FISH özeti Sonuç WHO Sınıflaması Hastalık kodu İmza ve tarih 23

Testlerin seçimi • Bu konularda laboratuvar direktörleri kullandıkları testlerin tanısal önemini belirlerken ilgili testlerin tanısal duyarlılık ve tanısal özgüllüğünü hesaplamaları gerekir. • Aynı zamanda testlerin Pozitif Öngörü ve Negatif Öngörü değerlerinin de hesaplanmaları gerekmektedir. • Uygulanan test çok özel bir tanıda kullanılacak ise Özgüllük ve Özgünlük değerlerinin %100’ e yakın olmaları gerekmektedir. 24

Cihazın değerlendirilmesi • Cihazların linearity, precision, referans metodlarını uygulamaları ve diğer bilinen metodları uygulayanlarla mukayese edilebilirliliği, Sensitivitesi, Spesifitesi, test başına düşen total maliyet aletin idame, bakım ve operasyonal standartları günlük tayin kapasitesinin tutarlılığı ve devamiyeti teknik kadronun cihazı kullanma kolaylılığı ve kabullenmesi 25

Veri toplanması, analiz ve işlenmesi • Günümüzde bütün laboratuvar sonuçlarının bilgisayar kaynaklı elde edilmesi, toplanması sunumu, hastaya verilmesi, analizi ve saklanması gerekmektedir. • Data Processing adı verilen bu işlemlerin de kalite kontrolleri ve standardizasyonları büyük önem kazanmıştır. • Sayısal değerlerin etraflıca ve güvenilir tekniklerle kontrolü ve doğrulandıklarına ait bilgiler de kolaylıkla ulaşılabilir olmalıdır. 26

Analiz öncesi ve sonrası • • • Laboratuvardan testlerin istenmesi Kan Örneklerinin alınması ve taşınması Sonuçların testi isteyen kurum veya doktora geri bildirimi Testlerin örnek alınmasından doktora sonuçların ulaştırılmasına kadar geçen sürecin denetimi (Test Turnaround Time) Testlerin yapıldığı hizmet ünitesinin yapısı (Point of care testing) 27

Kalite güvencesi • Hematoloji laboratuvarlarına örnek göndererek test sonuçlarını merak eden hekimler genelde laboratuvar tekniklerine ve testlerin uygulanması konularında etraflı bilgilere sahip değildirler. • Bu nedenle hematoloji laboratuvarları her analizinde yüksek standartta ve kalitede sonuç üretmek ve hekimi sonuçların önemi konusunda bilgilendirmek sorumluğu da taşımaktadır. 28

Kalite • Uluslararası düzeyde International Standards Organization (ISO) Kalite standartları için ISO 9000, ISO 17025 I ve ISO –IEC Guide 25 gibi kalite kontrolü ve kalite yönetimi konularında kurallar belirlemiştir. • Bazı ülkelerde ise hematoloji laboratuvarlarının Kalite Kontrolü ve Kalite Güvencesi için ülkedeki Kuruluşlara bu görevler verilmiştir. • Örneğin İngiltere de UK Accreditation Service (UKAS) ve European Accreditation of Laboratories (EAL) laboratuvar akreditasyonunu üstlenmişlerdir. 29

Hematoloji laboratuvarı - GMP • • • SOP ( standart operating procedures) lerin yazılması SOP lerin uygulanması Tüm yapılan çalışmaların kaydedilmesi Eğitim ile kalifiye personel Uygun çalışma ortamının ve aletlerin dızaynı Şemaya göre temizliğin düzenli yapılması Aletlerin, personelin, işleyişin validasyonu Koruyucu önlemlerin alınması Kalitenin kontrol edilmesi Yukarıdakilerin audit edilmesi 30

Hematoloji laboratuvarı – Kalite programı • • • Kayıtların korunması ve SOP ler Personel seçimi ve eğitimi Validasyon, kalibrasyon, koruyucu önlemler, yeterlilik testi Destek hizmetinin kalitesi Yanlışlıkların düzeltilmesi İşleyişin iyileştirilmesi İşleyişin kontrolü Etiket kontrolü İnternal audit 31

Hematoloji laboratuvarı – Kalite programı • • Kalite kontrol ve yeterlilik testleri İnternal ve external audit Personel ve organizasyon Fiziki yapı ve teknik donanım Dökümentasyon Kan işleme Yanlışlık ve kazaların araştırılması İşleyişdeki şikayet ve sorunların geri dönüşü 32

• Ülkemizde standardizasyon ve akrediatsyon konularının en yetkili kurum Türk Akreditasyon Kurumu dur(TÜRKAK) • TÜRKAK 1999 yılında 4457 sayılı kanun ile kurulmuştur 33

• ISO (The International Organization for Standardization) • ILAC(The International Laboratory Accreditation Cooperation) Tıbbi laboratuarların kalibrasyon ve test teorik ve prosedürlerini geliştirme konusunda dünyanın temel forumlarından birisidir. Bu forum halk sağlığı, çevresel durumlar ve uluslarası ticarete uygun karar vermektedir. • IAF The International Accreditation Forum ise temelde akreditasyon konularını ve ilgi alanlarını belirleyen, yönetim sistem, kalite, üretim, personel ve diğer konularda değerlendirmeyi yapan bir bölümdür. 34

• ISO NU 2007 ( sektör spesifik teknik uyumluluk ve yönetim sistem standartı)’e akredite edilmiş tıbbi laboratuarlar. I, ISO 9001 ile 2008 yönetim sistem prensipleri toplantısında tekrar tanındılar. • ISO, ILAC ve IAF birleşik grubunun konu hakkındaki resmi bildirisi Eylül 2009 ‘da yayınlandı. Bu birleşik grup resmi yazısında ISO 15189. 2007’nin tıbbi laboratuarlar ile ilgili yanlış veya eksik kısımları nedeniyle mevcut haliyle işlevselliğini kaybettiğini belirtti. • Bugüne dek, akredite edilmiş tıbbi laboratuarlar müşterilerine karşı bu işlerdeki tam yetkiliklerini gösterebilmek için ISO 9001: 2008 sertifikalarını göstermek konusunda isteklere maruz kalmaktaydılar. 35

• Yeni uygulama ile ISO 15189’ a akredite olan tıbbi laboratuvarlar, ISO 9001: 2008 kalite-yönetim temel prensipleri uygunluğu için de kabul edilmiş sayılacaktır. • Sadece ISO 15189 kriterlerini yerine getirebilmiş olma durumları irdelenecektir. • Bu yeni sistem maliyet ve gereğinden fazla zaman kaybını azaltacak ve müşteri ihtiyacının daha iyi karşılanmasına yol açacaktır. 36

• Hematoloji laboraruvarında uygulanan bütün işlemlerin etraflı yazılmış ve laboratuvar yetkilisi tarafından onaylanmış belgelerinin hazırlanması gerekir. Bu yazımlar kan alınışını, testin çok etraflı bir anlatımla uygulanışını, dikkat edilmesi gereken laboratuvar güvenliği konularını, veri analizi, veri toplama ve veri rapor etme işlemlerine kadar bütün bilgileri içerecek şekilde hazırlanmalıdır. 37

• Birçok hematoloji laboratuvarında aynı test aynı cihaz ve teknikle uygulanmasına rağmen her laboratuvar kendi SOP’lerini hazırlamak zorundadır. • Laboratuvar SOP’leri kolay ulaşılabilir bir yerde saklanmalı ve her yıl yenilenmelidir. • Dosyalarda SOP’lerin gözden geçirilme, varsa revizyonlar ve yeni onay tarihleri belirtilmelidir 38

Kalite- Şirket- Düşünce • Kalite pahalıdır • • • Denetim kalitenin anahtarıdır. Kaliteyi kontrol uzmanları ve müfettişler ile sağlayabilirsiniz Kusur çalışanlar tarafından oluşturulur Korku ve ödül motive etmek için uygun yollardır. Çalışanlardan en iyi performansı ödüllendir ve kötüleri cezalandır. Tek bir tedarikçiden satın alma uygundur. • 39

Kalite-şirket- uygulama • Kalite, düşük maliyetlerde olabilir • Kontrol hatasız üretime yol açabilir • Çalışanlar hatasız olabilir • Kaliteyi yönetim belirler • Süreç her zaman optimize edilebilir • Korku felakete yol açar • İnsanlar, işlerini güven hissederek yapmalıdır • Tedarikçiler her zaman değiştirilebilir. 40

41

1960 1970 1980 1990 2000 2010 Teknoloji Basit laboratuvar testleri ile klinik incelemeler Protein kimyası DNA teknolojisi, Gen araştırmalar Regeneratif tıp 42

43

44

Hematoloji laboratuvarı ne yapar ? • Anemi tanısı ve ayırıcı tanısı • Hemostaz ve tromboz hastalıklarının tanısı ve izlemi • Hematolojik malignansilerin tanısı ve izlemi için gereklidir 45

Hematolojide laboratuvar • Rutin incelemeler için modern hematoloji analizörleri mevcuttur. • Hematolojide Otomasyon-analizör teknolojisi: – Doğru ve hızlı netice elde etmeyi sağlar • Avantajları: – – Daha fazla bilgi, tekrarlanabilirlik Zamandan tasarruf Kişiden tasarruf Daha ucuz 46

Hematolojide laboratuvar Rutin testler: • Tam kan sayımı: • Periferik yayma: Hücre morfolojisi • Koagulasyon testleri: PT, a. PTT, fibrinojen • Serum demir. TDBK, ferritin • Vitamin B 12 ve folat düzeyleri • Hemoglobin elektroforezi, • Ozmotik frajilite, otohemoliz vb. 47

Hematolojide laboratuvar Özel üniteler: • Aggregometre • Tromboelastografi • Elısa, • Nefelometre • Kemiimülesans • RIA • Moleküler tanı labaratuarı: – Flow cytometry: – PCR : 48

Koagulometre • • • • PT a. PTT Fibrinojen Fibrin Yıkım ürünleri Koagulasyon faktör düzeyleri D-Dimer Lupus antikoagulanı DRVV testi APC rezistansı Protein C Protein S Antithrombin-ııı VWb faktör antijen düzeyi 49

Aggregometre • Kalıtsal ve akkiz trombosit fonksiyon bozukluklarının tanısı • ADP, Kollagen, ristosetin, araşidonik asit ile aggregasyon yanıtı • Ristosetin kofaktör: von. Willebrand hastalığı • Heparine bağlı trombositopeni tanısı 50

Tromboelastograf • Global koagulasyonu değerlendirmeyi sağlar • Pıhtının oluşumu ve lizisi sırasında oluşan değişiklikleri grafik olarak verir • Koagulasyon fonksiyonunu monitorize etmekte ve trombosit fonksiyonunu inhibe eden ilaçların etkisini araştırmada kullanılır 51

Moleküler hematoloji • Akım sitometri (Flow cytometry) • Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 52

Akım sitometri • Hücrenin birçok fiziksel özelliğini (CD) aynı anda değerlendiren teknoloji 53

Akım sitometri kullanım alanları • Hematoloji • İmmünoloji • Mikrobiyoloji • Diğer 54

Akım sitometri - Hematoloji • • • Lösemi – Lenfoma İmmunfenotipleme İlaç rezistansı Hematopoetik progenitor hücre analizi (CD 34+) PNH paneli Retikülosit İmmuno – platelet sayımı Antitrombosit antikor Antinötrofil antikor Feto – maternal hemoraji Lenfosit alt grupları DNA ve S fazı analiz Proliferasyon markerları 55

Akım sitometri – Kök hücre nakli • • CD 34 analizi Hücre canlılık testi(7 AAD) CD 4 - CD 8 hücre sayısı Cross-Match 56

• İnsülin • Heparin, Tromboplastin • Pıhtılaşma faktörleri 57

Protrombin Zamanı • 1938 yılında tanımlandı ve çok geniş kullanım alanı buldu • Ancak testin basitliğine karşın tüm Dünya da standardizasyonunda ciddi problemler yaşandı. 58

• Protrombin zamanı (PZ) testi, koagülasyonun ekstrinsik yolunun incelenmesinde kullanılan bir testtir. Test, tek aamalı Quick Metodu ile sitrat içeren plazma örneklerine tam doku tromboplastini (akcier, beyin veya plasenta kaynaklı doku tromboplastini - fosfolipid ekstraktı) ve kalsiyum eklenmesinden sonra, fibrin pıhtı oluşum süresinin ölçülmesi esasına dayanmaktadır.

• PT nin standardizasyonunda iki temel yöntem vardır, bunlardan birincisi WHO tarafında kullanılan International Reference Preparations (IRP) • Lokal olarak ölçümlerde kullanılan International Normalized Ratio (INR). 60

• PZ testini etkileyen en önemli değişken, reaktifte bulunan tromboplastindir. Ticari tromboplastinlerin warfarine olan duyarlılıkları farklı olduğundan, farklı tromboplastinler kullanılarak elde edilen sonuçların direkt karılatırılması karışıklığa neden olabilmektedir. Yüksek duyarlılıktaki tromboplastin reaktifleri (düşük International Sensitivity Index (ISI)’li), düşük duyarlılıktakilere (yüksek ISI’lı) oranla daha fazla bir uzamaya yol açarlar.

• Yani bir hasta, duyarlılığı düşük bir tromboplastin reaktifi ile 14 saniye ve duyarlılığı yüksek bir reaktifle 18 saniye gibi bir PZ değerine sahip olabilir

• Farklı tromboplastinler kullanılarak elde edilen PZ sonuçlarının karşılatırılmasındaki güçlükler nedeni ile, Dünya Salık Örgütü (WHO) 1977’de tromboplastin için uluslararası bir referans preparatı (International. Reference Preparation: IRP) oluşturmuştur. 1983 yılında ise, PZ standardizasyonu için Uluslararası Normalleştirilmiş Oran (International Normalized Ratio= INR) esasına dayanan bir model tanımlamıştır

• Geleneksel olarak ISI değeri, manuel yöntemle test tromboplastini ve uluslararası referans tromboplastin ile 60 stabil OAT gören hasta örneği ve 20 sağlıklı kontrol örneğinden elde edilen sonuçların karşılatırılması ile belirlenmektedir. Sonuçların logaritmaları arasındaki lineer ilşikide eğim, test tromboplastininin ISI değeridir.

INR İNR= (HASTANIN PT : NORMAL PT) ısı değeri • International Sensitivity Index: Kullanılan tromboplastinin duyarlığını gösterir. • ISI değeri 1’e yakın olan daha iyi 65

Hedef • INR, 2 nin üzerinde tutulacak (2 -3. 5).

Kan alma • Antekübital bölge, parmak ucu, topuk, nadiren kulak memesi uygun cilt temizliği sağlandıktan sonra kapiller veya venöz kan manuel kan sayımı ve periferik yayma için kapiller venöz kan diğer tüm testler için kan alınan bölge sıkılarak kan miktarı arttırılmamalı, (Doku faktörünün ve lökositlerin örneğe karışması artar) 67

Teknik Hatalar • • Yanlış antikoagülan kullanımı Tüpün eksik doldurulması Yetersiz karıştırma Isı yönünden yanlış saklama 68

İdeal örnek koşulları • • • Atravmatik ve mümkünse turnikesiz kan alımı. İşaret çizgisine kadar tam doldurulması Yeterince antikoagülan ile , iyice karıştırılması. Oda sıcaklığında hemen ulaşım. Gerekiyorsa santrifugasyon bir saat içinde yapılmış ve sonrasında hemen çalışılmış olmalı. 69

Çalışılmayacak örnekler • Sitrat dışı antikoagülan kullanılmış, • İçinde pıhtı olan, • Kan- antikoagülanı uygun olmayan • Miktarı uygun olmayan, • Htc’ in %55 in üzerinde olduğu, • Hemolizli Örnekler kabul EDİLMEZ. 70

Tam kan sayımı için hata kaynakları • • Aç karnına alınmasına gerek yok. Uzun süreli turnike uygulanması (hemokonsantrasyon), Kapiller veya venöz kan, Antikoagülan kaynaklı hatalar, yanlış tüp Yetersiz veya fazla antikoagülan, Yetersiz karıştırma, Laboratuvara geç ulaştırma veya geç çalışma, Diürnal değişim, postür, 71

72

• Tromboplastinin daha öncede tanımlanmış olan standardı olmaması nedeni ile tromboplastin kimyasalları zaman içinde konsensus kararı ile International sensitivity Index” (ISI) : 1. 0 ‘ e indekslenmiştir. 73

Tromboplastin kaynakları • • İnsan Tavşan Dana Domuz 74

• Sonuç olarak tromboplastin kaynağının standardizasyonu ISI için, kullanılan enstrumentasyon ise INR standardizasyonunu sağlamaktadır. 75

76

Trombosit disfonksiyonu Adeziv proteinlerin reseptör anormalliği - GPIb-IX-V kompleks (Berbard-Soelier Sendromu, Platelet tip von Willebrand hastalığı - GPIIb-IIIa (αIIbβ 3; Glanzman trombositopenisi) - GPIa-Iıa (α 2β 1) - GPVI - GPIV Solubl agonistelerin reseptör anormalliği - δ-granül (δ-depo havuz yetmeliği, Hermansky-Pudlak sendromu, Chaidak-Higashi sendromu, Radius yokluğu iel birlikte trombositopeni - α-granülleri (Gri platelet sendromu, ARC sendromu, Quebec platelet hastalığı, Paris-Trousseau-Jakobsen sendromu - α ve δ granülleri (α ve δ-depo havuz yetmezliği) - Sinyal transducer yolağı anormalliği Primer sekresyon defektleri - Araşidonik asit/Tromboksan A 2 yolak anormalliği - Gaq yetmezliği - Parsiyel selektif PLC-β 2 yetmezliği - Plecstrin fosforilasyon defektleri - Kalsiyum mobilizasyon defektleri Sitoskleton anormalliği - MYH 9 -ilişkili hastalıklar (May-Hegglin anomalisi, Sebastian sendromu, Fechiner sendromu, Epstain sendromu) - Wiskott-Aldrich sendromu - X-linked trombositopeni Membran fosfolipid anormalliği - Scott sendromu 77

• KÜÇÜK TROMBOSİT – – • NORMAL BOYUTLU TROMBOSİT – – – • Konjenital amegakaryositik trombositopeni Radio-ulnar sinositoz ile birlikte amegakaryositik trombositopeni Radius yokluğu ile birlikte trombositopeni Ailesel trombosit hastalıkları Otozomal dominant trombositopeni BÜYÜK TROMBOSİT – – – – – • Wiskott-Ladrich sendromu X-linked trombositopeni Bernard-Soulier sendromu di. Goerge/Velokardiofasiyal sendrom Platelet tip von Willebrand hastalığı Gri platelet sendromu ARC sendromu MHY 9 ilişkili hastalıklar Talassemi ile birlikte X-linked trombositopeni Paris-Trousseau-jacobsen sendromu Bening Akdeniz makrotrombositopenisi Diseritropoetik anemi ile trombositopeni 78

79

80

81

82

83

Heparin Sitrat (1: 9) Kuru kan EDTA Sitrat (0, 4: 1, 6) Lityum 84

Antikoagulan maddeler • Sodyum sitrat: – – %3. 8’lik sitrat solüsyonu, kalsiyum ile şelat Hct %45 iken oran 1 birim sitrat: 9 birim kan Hct >%50 iken sitrat oranını azaltmak gerekir. Kan sayımı ve koagülasyon testleri için gerekli 85

Antikoagulan maddeler • Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA): Güçlü antikoagülan ajan, Kalsiyum ile şelat EDTA-potasyum tuzu (1 ml kan+1 mg EDTA) Kan sayımı için ideal antikoagülan Trombositlerde agregasyonu uyarabilir ve psödotrombositopeniye yol açar. – Moleküler yöntemler (DNA/RNA izolasyonu; PCR vs) • DAT için EDTA’lı tüp tercih edilir. Çünkü EDTA in vitro kompleman bağlanmasını önler (yoksa kompleman yanlış pozitifliğe yol açabilir) – – 86

Psödotrombositopeni • EDTA’ya bağlı kümelenme • Doğrulamak için periferik yaymada trombositler değerlendirilmeli • Sitratlı kanda trombosit sayılmalı 87

Antikoagulan maddeler • Heparin: – – – 1 ml kan için 10 -50 Ü heparin Kan hücrelerinin şeklinin bozmaz. İmmunolojik testler için hücre gerektiğinde kullanılır Pıhtılaşmayı ANTİTROMBİN III üzerinden inhibe eder Sitogenetik (G bandlama) 88

Antikoagulan maddeler • Asit-sitrat-dekstroz (ACD) – Kan bankalarında transfüzyon için alınan kanlarda kullanılan antikoagülan – Trombosit çalışmaları için • Kuru oksalat – Nadiren kullanılan antikoagülan – Hücrelerin yapısını bozacağı için periferik yayma hemen yapılmalıdır – 1 ml kan : 2 mg oksalat 89

RBC Histogramları R B C Parçalanmış eritrositler Eritrosit aggregatlarısoğuk aglütininler S a y ı s ı İki farklı eritrosit populasyonu, Kan transfüzyonu sonrası, mikrositoz-makrositoz tedavisine yanıt sonrası, miyelodisplazide görülür. R B C S a y ı s ı % % 50 80 150 Volüm (flt) 90

Ortalama eritrosit hacmi Mean Corpuscular Volume (MCV) • Direkt olarak ölçülen parametre, • MCV=Hct(%) X 10÷RBC (milyon) • Anemilerin morfolojik sınıflamasında önemli, • Mikrositoz <80 fl • Makrositoz >94 fl • 80 -94 Normositler • Yüksek lenfosit sayısı, • Hiperglisemi MCV ↑ MİKROSİTOZ < 80 flt MAKROSİTOZ >94 flt R B C S a y ı s ı 50 90 150 Volüm (flt) 91

Eritrosit sedimentasyon hızı - 1 • Sistemik hastalıkların tanısında veya hastalığın aktivitesini göstermesin kullanılan bir test • Akut inflamatuvar faz yanıtı olarak değerlendirilir. • Eritrosit yüzeyindeki negatif elektrik yükün (zeta potansiyel) değişmesi sonucu • 0. 4 ml %3. 8 Na-sitrat + 1. 6 ml kan • Westergren yöntemi ile saatlik ölçüm 92

Eritrosit sedimentasyon hızı - 2 • • Normal değer Kadın 3 -20/saat; Erkek 3 -15 mm/saat Yaşla beraber artar. Yaşla ilgili düzeltme, Erkek; Yaş/2 normalin üst sınırı Kadın Yaş+10/2 normalin üst sınırı Hipofibrinojenemi, polisitemia verada düşük Tüm akut kronik inflamasyonlar, maligniteler kolagen doku hastalıkları vs’de artar 93

Damar bozuklukları - Trombositler • Trombosit sayımı-periferik yayma • Kanama zamanı: Ivy yöntemi-Ön kol; 2 -8 dak. – Uzama: Trombositopeni, trombosit işlev bozuklukları, von Willebrand hastalığı • Turnike testi • Trombosit agregasyon testleri • Trombosit fonksiyon analizörü (PFA-100) 94

Pıhtılaşma testleri - 1 • Pıhtılaşma zamanı: – İn vitro intrensek sistemi ölçen kaba bir test, normali 4 -10 dk • Aktive parsiyel tromboplastin zamanı: – İntrensek sistemi ölçen hassas bir test – Antikoagülanlı kana sefalin/kaolin/elajik asit ve kalsiyum eklenerek intrensek sistemi ölçen test, normali 25 -40 sn. 95

Aktive parsiyel tromboplastin zamanı (a. PTT) • Prensip: – 9 birim tam kan 1 birim sitrat’lı tüp içine alınır – PLT poor plazma işlenir – Sitratlı plazma 37 C’de a. PTT reagent (fosfolipid+kontakt aktivatör reagent) ile inkübe edilir – Kalsiyum klorid eklenir ve pıhtılaşma zamanı ölçülür • Tek aşamalı pıhtılaşma testidir • Pıhtılaşma bozukluklarını tarar – İntrinsik sistemdeki tüm faktörleri (FI, II, V, VIII, IX, X, XI ve XII) test eder – Faktör VII aktivitesini ölçmez • Reagent özellikleri: – a. PTT reagentı fosfolipid içerir: PF-3 kaynağı olarak – a. PTT reagentı mikronized silika içerir: kontakt aktivasyonu için yüzey olarak vazife görür 96

a. PTT Plazma=sitratlı PLT poor plazma Plazma Kontakt aktivator Fosfolipid Sefalin, Inosothin Ca. Cl 2 Pıhtılaşma zamanı a. PTT reagent=fosfolipid+kontakt aktivatör reagent Kaolin Elajik asid Silika 23 - 35” 97

Uzamış a. PTT Kanamalı hasta • – – Heparin Von Willebrand hastalığı Hemofili A veya B, Eğer erkek hasta ise FXI eksikliği Kanamayan veya Pıhtılı hasta • – – Lupus antikoagulan Kontakt faktor eksikliği • FXII, PK (Fitzgerald faktör, Fletcher factor) ve HMWK eksikliği 98

a. PTT - Dikkat edilmesi gerekenler • • • Sitratlı tüp 2 tüp metodu kullan Heparinli kateter kan alma Oda ısısında transport Vakum intakt olmak zorunda (kapağı açma) 12 saat stabl 99

Pıhtılaşma testleri - 2 • Protrombin Zamanı – Antikoagülanlı kana tromboplastin ve kalsiyum ekleyerek ekstrensek sistemi ölçer – Normali 12 -14 sn – % aktivite ve INR parametreler ile tanımlanır – INR: Normalleştirilmiş uluslararası oran 100

Protrombin zamanı (PT) • Prensip: – Kalsiyum bağlayan antikoagülan (sitrat veya oksalat) eklenmiş kandan elde edilen plazma (sitrat: kan oranı önemlidir), doku faktörü varlığında, re-kalsifiye olduğunda birkaç sn içinde pıhtılaşacaktır. • Kalsiyum-doku faktörü karışımına ilavesi ve tespit edilebilir bir pıhtı oluşumu arasında geçen zaman PT’dir. 101

Protrombin zamanı (PT) Hasta Plazma Doku Tromboplastin ve Ca++ Kaynaklar 11 - 14” Beyin: İnsan Tavşan Keçi Plasenta: İnsan Rekombinant 102

Uzamış PT • A. Konjenital izole faktör eksiklikleri – – • FVII eksikliği FI, II, V, ve X eksiklikleri B. Kazanılmış multipl faktör eksiklikleri – Hastanede yatan hastalarda sık – FII, V, VII, ve X • Kumadin tedavisi (FII, VII, IX, X) • Parankimal Karaciğer hastalığı (FII, V, VII, IX, X) • Vitamin K eksikliği (FII, VII, IX, X) – Bilier obs, yağ abs bozuk (sprue, celiac, kronik diare, ZES) • DIK • Fibrinolizis • • C. Dolaşan antikoagülanlar: SLE PT için kullanılan çoğu regaent heparini nötralize etmek için bir kimyasal içerir. – Test bu nedenle heparin tedavisine duyarlı değildir. 103

Pıhtılaşma testleri - 3 • Trombin Zamanı – Plazmaya 5 Ü’lik trombin eklenmesi ile ölçülür – Normali 18 -21 sn – Hipofibrinojenemide, heparin tedavisinde ve fibrin yıkım ürünlerinin artışında uzama olur. • Fibrinojen düzeyi: 200 -400 mg % 104

Trombin zamanı - 1 • Prensip: – 9 birim tam kan 1 birim sitrat antikoagülan tüp içine alınır – PLT poor plazma işlenir – Trombin plazmaya eklendiğinde, fibrinojen fibrin pıhtısına dönüşür – Test trombin eklendiğinde pıhtı oluşumu için gerekli zamanı ölçer • Test yüksek konsantrasyonda fibrinojen ve sınırlı konsantrasyonda trombin ile yapılır • Reaksiyon koşulları testi 100 -600 mg/d. L aralığında fibrinojen konsantrasyonuna duyarsız yapar • Çok yüksek veya çok düşük fibrinojen ile zaman uzar 105

Trombin zamanı - 2 • Amaç: – Trombin-fibrinojen etkileşim inhibitörlerini veya – Fibrin monomer polimerizasyon inhibitörlerini tespit etmektir. • TT= 18 -22 sn (7 -12 sn) (referans aralık) • Kritik değer >69 sn 106

TT - Uzun 1) Heparin – Düşük konsantrasyonda heparin varlığında bile TT uzar (Testten 2 gün önce heparin almamalı). 2) Fibrinojen yıkım ürünleri fazla 3) Anormal fibrinojen varlığı – örnek= yenidoğanda fetal fibrinojen 4) Ciddi hipofibrinojenemi, afibrinojenemi – 80 mg/d. L 5) Paraproteinler – MM değişken yanıt verir fakat genellikle TT uzatır. 6) DIK 7) Fibrinolizis 8) Ciddi Kc hastalığı 107

Fibrinojen • Prensip: – 9 birim tam kan 1 birim sitrat’lı tüp içine alınır – PLT poor plazma işlenir – Fazla miktar trombin dilüe edilmiş sitratlı plazmaya (1: 10) fibrinojeni fibrine dönüştürmesi için eklenir ve pıhtılaşma zamanı ölçülür. – Miktarı bilinen fibrinojen içeren plazma (standart fibrinojen)’nın pıhtılaşma zamanı ile karşılaştırılır. Standart bir eğri oluşturulur ve mg/d. L fibrinojen karşılık saniyedeki pıhtılaşma zamanı işaretlenir. 108

Kazanılmış hipofibrinojenemi • • Karaciğer hastalığı-Asit DIK (sekonder fibrinolizis) Primer fibrinolizis – Siroz, şok, metastatik prostat CA, GUS travma İlaçlar – L-asparaginaz, alkol, tiklopidin, vb. Kanser Heparin Disfibrinojemi 109

D - Dimer İşlem: • Sodyum sitrat içeren bir tübe 4. 5 ml venöz kan örneği alınır. • Oda ısısında 4 saat stabil kalır. 110

D-Dimer Ölçüm sistemleri: • Manual Latex Aglutinasyon: Kaba, duyarlı değil • Mikrotitre plate ELISA : >2 saat, bir parti/dizi örnek gerekir • Immunofiltrasyon ölçümleri • Otomatik ELISA sistemi : Tek örnek çalışılması mümkün, 35 dk • Latex tabanlı fotometrik/ turbidometrik immunoassay: • İleri D-dimer ölçümleri: 10 dk zaman alır, otomatik gözlemci okuma, ucuz bağımsız 111

DİK ve D-Dimer • DİK tanısında – D-dimer testi DİK tanısında FYÜ testlerinden daha değerlidir. – D-dimer testi in vivo fibrinolizisi doğrular. • Çünkü D-dimerler sadece çapraz bağlı fibine plazminin etkisi ile oluşturulur (pıhtılaşmamış fibrinojenin üzerine plazminin etkisi ile oluşmaz). – Pozitif d-dimer testi DİK için olası kanıttır. 112

D-Dimer yüksekliği • • • DİK (sekonder fibrinolizis) Arteriyel ve venöz tromboz Primer fibrinolizis Pulmoner emboli Post-operatif Travma Kanser Gebelik (son dönemi) postpartum Orak hücreli anemi krizi Hematom Trombolitikler (T-PA tedavisi) 113

Özel testler • • • Pıhtılaşma faktör düzeyleri Von Willebrand faktör tayini v. WF ristosetin kofaktör aktivitesi Yaygın damar içi pıhtılaşma testleri Fibrinolitik sistemin testleri Doğal inhibitör testleri 114

Faktör düzeyi ölçümleri • Normal Pool plazma • Hasta plazma (faktör eksik plazma) =100% (F 8)--- 30 sn (PTT) = ? % (F 8)--- ? Sn (PTT) • Normal Pool plazma+ Hasta plazma = – – – PTT 1+0 1+ 1 (1: 2) 1+3 (1: 4) 1+7 (1: 8) 1+15 (1: 16) =100% (F 8)--- 30 sn (PTT) = 50% (F 8)--- 35 sn = 25% (F 8)--- 40 sn = 12. 5% (F 8)---45 sn = 6. 25% (F 8)---50 sn 50 45 Ucuz yöntem 40 35 30 Faktör düzeyi 6. 25 12. 5 25 50 100 115

Mikst çalışma AMAÇ: • Faktör eksikliği ile inhibitör arasında ayırım yapmak için bir tarama çalışmasıdır. PRENSİP: • Hasta plazması ile normal pooled plazma karıştırılır ve PTT yapılır – Eğer kontrole göre tamamen düzelirse İNHİBİTÖR YOK – Eğer kontrole göre düzelme yok veya kısmen düzelme varsa İNHİBİTÖR 116

Mikst çalışma Normal Pooled Plazma (NPP) NPP: PP Miks 1: 1 Miks PTT Karşılatır Hasta Plasma (PP) NPP: IBS Miks 1: 1 (kontrol) NPP: PP’nın PTT si NPP: IBS’nin den 1 sn daha uzun ise INHIBITOR 117

İnhibitör • Normal faktör düzeyini %50 nötralize eden inhibitörlü plazmanın dilüsyon oranı Bethasda Unit (BU) olarak inhibitör titresini verir. – Bu düzey<5= düşük inhibitör düzeyi – Bu düzey>5= yüksek inhibitör düzeyi 118

Von Willabrand faktör (v. WF) düzey ölçümü • • v. WF eksikliği düşünülenlerde v. WF konsantresi veya DDAVP tedavisi sonrası takip Stres ve fiziksel aktivite v. WF (ve FVIII) düzeyini artırır. – Bu nedenle kan örneği istirahatta alınmalı Hamilelik v. WF düzeyini artırır 119

v. WF antijen düzeyi v. WH Ag: – Dolaşan v. WF miktarını ölçer Method: – İmmunolojik ELISA – Latex immunassay (LIA) – Laurell rocket elektroforezis 120

Niçin CD 34 analizi ? • Canlı CD 34+ hücre sayısı toplanan kök hücrelerin alıcıda yeşerme potansiyelini belirler 2 -5 x 106 /kg CD 34+ hücre gerekli 121

Toplanan kök hücrenin engraftman potansiyelini belirleyen nedir ? • • Üründeki lökosit sayısı Üründeki TNC sayısı CFU-GM sayısı CD 34+ hücre miktarı 122

CD 34 Kök hücre ? • Kemik iliğindeki hücrelerin % 1 -3’ü CD 34 eksprese eder. • Kord kanında % 0, 3 • Periferik kandaki hücrelerin %0. 01 -0. 1’i CD 34 eksprese eder. Ancak mobilizasyon rejimleri ile periferik kandaki CD 34+hücre sayısı arttırılabilir • Glikolize müsin benzeri yapıya sahiptir • Myeloablative tedavi sonrası uzun süreli çok yönlü hematopoezin oluşmasını sağlar 123

Akım sitometri - İmmünoloji • • HLA – B 27 İmmün yetmezlik Fagositoz, Burst testi Hücre içi sitokinler 124

Akım sitometri - Diğer • Apoptozis • Hücre aktivasyonu • Hücre fonksiyonu • Sinyal yolakları 125

PCR – Koagulasyon hastalıkları • Faktör V Leiden: – Hiperkoagulabilite • Protrombin 20210 A: – Hiperkoagulabilite • MTHFR A 223 V mutasyonu: – Hiperhomosisteinemi-vasküler risk • 5 - Platelet antijen polimorfizmi : – Vasküler risk 126

PCR – Lösemi / Lenfoma • T lenfosit klonalite: – T lenfosit beta, gamma reseptör gene rearrengement • B lenfosit klonalite: – B lenfosit Ig. H gene rearrangement • t (11: 14): – Mantle cell lenfoma • t (14: 18): – Folliküler lenfoma- bcl-2 • t (9: 22): – Kronik myelositik lösemi • Ras mutasyon, p 53 mutasyon, BRCA 1, BRA 2 mutasyon • Minimal Rezidüel hastalık (Kalıntı hastalık) 127

PCR – Kemik iliği • HLA doku grubunun saptanması A-B-C, Dr, Dp, DQ lokusları • Chimerism tayini • CMV antijenemi 128

İLGİNİZ VE SABRINIZ İÇİN TEŞEKKÜR EDERİM