Hemaglutinacija Direktni i indirektni antiglobulinski test Iregularna protutijela

Hemaglutinacija Direktni i indirektni antiglobulinski test Iregularna protutijela 1

Hemaglutinacija • Proces aglutinacije eritrocita koji je posredovan protutijelima • Zbog negativnog naboja površine eritrocita oni se međusobno odbijaju • Premda u krvi ima protutijela i eritrocita ne dolazi do aglutinacije • Protutijela se ne vežu na vlastite antigene (iznimka su autoimune bolesti) 2

Hemaglutinacija • Površina eritrocita ima negativan naboj • Oko eritrocita je oblak pozitivnih iona koji putije s eritrocitom • Napetost između površine eritrocita i kraja tog oblaka zove se ZETAPOTENCIJAL • Zbog njega se eritrociti odbijaju 3

Hemaglutinacija • Hemaglutinacija je reakcija između protutijela u serumu i antigena na eritrocitu • Protutijelo se veže na antigen Fab dijelom 4

Hemaglutinacija • hemaglutinacija nastaje kad prututijela Fab dijelovima premoste eritrocite 5

Hemaglutinacija • Odvija se u dvije faze: 1. Faza – protutijela se vežu za antigene na membrani eritrocita, to je faza oblaganja ili senzibilizacije – reakcija nije vidljiva 2. Faza - protutijela stvaraju mostove između eritrocita – reakcija postaje vidljiva Ovaj proces u stvari teče paralelno 6

Hemaglutinacija • Proces i jačina aglutinacije ovise o: 1. Mjestu antigena (ugljkikohidrati –ag. krvnih grupa ABO jako strše, lipoproteini – ag. Rh provlače se kroz membranu erutrocita ) 2. Veličini protutijela - raspon između Fab dijelova kod Ig. G protutijela je 14 nm kod Ig. M 35 nm (udaljenost među eritrocitima je 25 nm) pa su Ig. M protutijela bolji aglutinini 3. Broj protutijela u odnosu na kličinu antigena(potrebna ravnoteža u omjeru antigena i protutijela inače reakcija slaba ili negativna) 7

Hemaglutinacija 4. Temparatura (Ig. M temperaturni optimum od +4 do 270 C, Ig. G na 370 C) Život eritrocita obično skraćuju protutijela aktivna na temperaturi višoj od 300 C 5. p. H slabo djeluje na aglutinaciju eritrocita 8

6. Ionska jakost • Smanjenje ionske napetosti smanjuje gustoću kationa i povećava elektrostatsko privlačenje + nabijenih Fab dijelova i – nabijene površine eritrocita 9

7. Djelovanje lissa - niskoionska otopina • Liss smanjuje količinu pozitivnog naboja oko eritrocita pa se protutijelo lakše veže 10

8. Antihumani gamaglobulin (AHG) • Razmak između vezanih protutijela može se premostiti protutijelima koja imaju specifičnost usmjerenu prema Fc dijelu Ig. G • Dodatkom AHG povezuju se senzibilizirani eritrociti u mrežu i nastaje aglutinacija 11

Hemoliza • Nastaje kao posljedica aktivacije komplementa • Komplement lakše aktiviraju Ig. M protutijela( 5 Fc fragmenata, Ig. G samo 1) • Krajnji rezultat je oštećenje membrane eritrocita i izlazak hemoglobina • Ako se komplement ne aktivira do litičkog kompleksa eritrociti budu obloženi aktiviranim komponentama komplementa i takvi eritrociti se ubrzano razgrađuju u jetri 12

Testovi hemaglutinacije Mogu se izvoditi: • • Na pločici U epruveti U kolonama(kartice) Na mikrotitar pločama 13

Direktni antiglobulinski test (DAT) ili direktni Coombsov test • Test kojim dokazujemo protutijela vezana na eritrocite • Testiranje se može raditi: u epruveti na mikrokartici u gelu 14

Direktni antiglobulinski test- princip • U krvi se nalaze razna protutijela, a među njima su i ona specifična za određeni antigen 15

Direktni antiglobulinski test-princip • Nakon ispiranja eritrocita s fiziološkom otopinom ostaju samo protutijela vezana na eritrocite 16

Direktni antiglobulinski test-princip • Nakon dodavanja AHG seruma ( protutijela na Fc fragment imunoglobulina G) dolazi do aglutinacije eritrocita 17

Direktni antiglobulinski test-princip • Ako se eritrociti slabo isperu i preostane još slobodnih imunoglobulina Ig. G (neke druge specifičnosti) među eritrocitima dolazi do vezanja AHG na te Ig. G i lažno negativne reakcije 18

Indirektni antiglobulinski test (IAT) ili indirektni Coombsov test • Ovim testom dokazujemo slobodna protutijela u serumu ili plazmi koju ispitujemo • Testiranje se može raditi: u epruveti na mikrokartici u gelu 19

Indirektni antiglobulinski test-princip 20

• Svaki negativan DAT i IAT kontrolirati Coombs kontrolom • Coombs kontrola se sastoji od eritrocita koji su obloženi Ig. G protutijelima. • Ako je DAT i IAT stvarno negativan onda su slobodna protutijela iz AHG-a i nakon dodavanja Coombs kontrole reakcija postaje pozitivna • Ako je Coombs kontrola negativna test nije valjan i treba ga ponoviti 21

Iregularna protutijela • To su uglavnom imuna, stečena antieritrocitna protutijela • Posljedica su senzibilizacije transfuzijama krvi ili trudnoćom • Pripadaju rezredu imunoglobulina G i prolaze posteljicu pa mogu uzrokovato hemolitičku bolest novorođenčeta • Mogu uzrokovati hemolitičku transfuzijsku reakciju 22

Iregularna protutijela • Prisutna su u 3% bolničkih bolesnika • Prisutna su u manje od 1% davatelja krvi • Na nekim odjelima i više od 40% bolesnika ima prisutno neko iregularno protutijelo (centar za dijalizu, hematologija, onkologija - sve veliki potrošači krvi i pripravaka od krvi) 23

Iregularna protutijela • Dokazivanje se provodi testiranjem seruma s panel eritrocitima (krvne grupe O) • Na eritrocitima moraju biti zastupljeni svi najčešći antigeni • Testiaranje se vrši tehnikom indirektnog antiglobulinskog testa 24

Iregularna protutijela • Sva iregularna protutijela nisu klinički značajna • Klinički su značajna ona koja su aktivna na temp. 370 C • Hladna protutijela ne dovode do skraćenja života eritrocita i nisu klinički značajna ali prave smetnje u laboratorijsskom testiranju 25

Iregularna protutijela • Testiranje na prisustvo iregularnih protutijela je sastavni dio određivanja krvne grupe • Ako se nađe iregularno protutijelo potrebno je odrediti njegovu specifičnost • Ako se radi o trudnici treba odredi i titar protutijela • Problem su oni bolesnici koji stvore protutijela protiv više antigena jer je onda teško pronaći podudarnu krv za transfuzijsko liječenje 26