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H. Curtis, N. S. Barnes, A. Schnek, A. Massarini Invito alla biologia. azzurro Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 1

Capitolo 12 Ingegneria genetica e biotecnologie Lezione 1. Il DNA ricombinante Lezione 2. Tecniche per clonare e sequenziare il DNA Lezione 3. Batteri e piante geneticamente modificati Lezione 4. Animali geneticamente modificati Lezione 5. Biotecnologie e medicina Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 2

Gli studi sul DNA ricombinante La tecnologia del DNA ricombinante utilizza segmenti di DNA modificati e inseriti in altre cellule. Molto spesso vengono utilizzati, come vettori, plasmidi e virus. Gli studi sul DNA ricombinante consentono di isolare segmenti di DNA sufficientemente piccoli per: • analizzarli e manipolarli; • ottenerne molte copie; • conoscerne la sequenza nucleotidica; • identificarli nel nuovo sito di inserimento. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 3

Gli enzimi di restrizione • Gli enzimi di restrizione frammentano il DNA dei virus in corrispondenza di sequenze dette siti di restrizione. • Ne esistono oltre 3000 e ciascuno ha un sito di restrizione specifico. • Gli specifici segmenti che si formano in seguito al taglio di un determinato enzima di restrizione sono chiamati frammenti di restrizione. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 4

Gli enzimi di restrizione • Il taglio può essere netto (A) e generare estremità nette (blunt ends) oppure sfalsato (B) e generare sequenze a singolo filamento dette «estremità adesive» (sticky ends). Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 5

Gli enzimi di restrizione Grazie agli enzimi di restrizione e alle ligasi si può ottenere un plasmide ricombinante. • Le estremità adesive possono appaiarsi con segmenti di altri DNA tagliati dallo stesso enzima di restrizione. • I segmenti vengono poi saldati utilizzando gli enzimi ligasi. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 6

Gli m. RNA stampo Un’altra tecnica per ottenere specifici segmenti di DNA consiste nel partire da un m. RNA conosciuto che faccia da stampo. • La trascrittasi inversa sintetizza un DNA complementare (c. DNA). • La DNA polimerasi sintetizza il filamento di DNA complementare al c. DNA. • Si ottiene una sequenza di DNA a doppio filamento che può essere inserita nel cromosoma della cellula ospite. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 7

FISSA I CONCETTI • Definisci cosa si intende per enzima di restrizione, sito di restrizione e frammento di restrizione. • Quali tipi di tagli possono attuare gli enzimi di restrizione? • Descrivi il ruolo dell’enzima ligasi nella creazione di un plasmide ricombinante. • Che cos’è un c. DNA? Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 8

I vettori di clonaggio • Le molecole (o le particelle virali) in grado di trasportare un frammento di acido nucleico all’interno di un organismo sono dette vettori. • Plasmidi e virus sono vettori che, duplicandosi all’interno dei batteri, producono molte copie del gene estraneo. • Queste copie multiple, una volta separate dal vettore, sono dette cloni. • La tecnica per produrre molte copie identiche di DNA e detta clonaggio; se i cloni sono costituiti da interi organismi, il processo prende il nome di clonazione. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 9

La reazione a catena della polimerasi (PCR) La PCR è una tecnica per produrre molte copie di un frammento di DNA. Ciascun ciclo viene ripetuto più volte e prevede tre fasi: • denaturazione del DNA da copiare; • appaiamento della DNA polimerasi al primer; • sintesi della catena complementare. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 10

Il sequenziamento del DNA Il metodo Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA: • Si utilizza la DNA polimerasi per sintetizzare un filamento complementare al filamento di DNA da sequenziare. • Durante la sintesi vengono inglobati nucleotidi normali e dideossinucleotidi trifosfato (dd. NTP), che arrestano la polimerizzazione. • Alla fine del processo si ottengono frammenti di DNA di diversa lunghezza. • In base alla base terminale di ciascun filamento, si ricostruisce la sequenza di nucleotidi del DNA da sequenziare. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 11

FISSA I CONCETTI • Cosa sono i vettori di clonaggio? Fai due esempi di vettori. • Cos’è un clone? • Che differenza c’è tra clonaggio e clonazione? • A cosa serve la PCR? Descrivine le principali fasi. • A cosa serve il metodo Sanger? Descrivine le principali fasi. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 12

Le biotecnologie • Le biotecnologie sono tecnologie che prevedono l’uso di organismi per migliorare la vita della specie umana. • Sono associate soprattutto agli studi di genetica molecolare e hanno come punto di partenza gli studi sul DNA ricombinante. • Un organismo geneticamente modificato possiede un genoma manipolato inserendo, togliendo o spostando geni. • Un organismo transgenico ha nel proprio corredo cromosomico geni di un organismo di un’altra specie. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 13

Microrganismi transgenici L’utilizzo di batteri transgenici ha trovato applicazione in diversi ambiti: • per la produzione di proteine importanti in campo medico (come l’insulina e la somatostatina); • per la produzione di proteine importanti in campo agricolo; • per la produzione di enzimi importanti nel campo del biorisanamento (perché in grado di alterare la struttura di alcuni inquinanti). Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 14

Piante transgeniche L’applicazione delle biotecnologie alle piante ha portato alla produzione di: • piante resistenti agli erbicidi, nel cui genoma è stato inserito il gene di un batterio che vive nel suolo. • piante resistenti agli insetti, nel cui genoma è stato inserito il gene di un batterio che codifica per la tossina Bt letale per gli insetti. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 15

Piante transgeniche Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 16

Piante geneticamente modificate Diversi prodotti ortofrutticoli sono stati modificati geneticamente per migliorarne la qualità. Ad esempio: • nel pomodoro Flavr Savr sono stati disattivati i geni responsabili della maturazione per poterlo conservare più a lungo. • nel golden rice è stato aumentato il contenuto di vitamina A. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 17

Creazione di organismi transgenici Esistono diversi modi per inserire DNA esogeno in batteri ed eucarioti: • Shock termico, per inserire plasmidi all’interno di batteri. • Elettroporazione, per inserire vettori all’interno di batteri o cellule eucariotiche. • Bombardamento biolistico, per il trasferimento di DNA esogeno all’interno delle cellule vegetali. • Microiniezione, per il trasferimento di DNA esogeno all’interno delle cellule embrionali. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 18

FISSA I CONCETTI • Definisci il termine biotecnologia. • Che differenza c’è tra organismo geneticamente modificato e organismo transgenico? • In quali ambiti sono stati utilizzati batteri transgenici? • Descrivi il meccanismo d’azione delle piante Bt. • Elenca le tecniche usate per inserire DNA esogeno negli organismi. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 19

Animali geneticamente modificati L’applicazione delle biotecnologie agli animali ha molteplici obiettivi, tra cui: • l’individuazione di una cura per alcune malattie genetiche umane attraverso la sostituzione dei geni «difettosi» con geni «sani» ; • la creazione di animali con nuove caratteristiche utili alla ricerca o alla produzione industriale. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 20

Knockout genico Il knockout genico è una tecnica che consente l’inserimento di un gene intattivato in un organismo per studiare gli effetti della sua mancata espressione. I topi knockout sono un esempio di animali geneticamente modificati utilizzati per lo studio e la cura di malattie ereditarie umane. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 21

La clonazione • Le tecniche di clonazione permettono di ottenere cloni di interi animali. • Consistono nell’inserire il nucleo di una cellula somatica all’interno della cellula uovo di un altro organismo privata del proprio nucleo. • Il primo esperimento di clonazione di mammiferi ha portato alla nascita della pecora Dolly. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 22

FISSA I CONCETTI • In cosa consiste la tecnica del knockout genico? In che modo può essere utile alla ricerca? • Fai un esempio di animali knockout ottenuti in laboratorio. • In cosa consiste la tecnica della clonazione? • Qual è stato il primo mammifero clonato? Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 23

Le biotecnologie mediche Grazie alla tecnologia del DNA ricombinante, oggi sono disponibili: • test per la diagnosi prenatale di alcune malattie genetiche ereditarie; • test genetici per la rilevazione di anomalie nei geni associati ad alcuni tipi di tumore; • vaccini ricombinanti, contenenti capsidi proteici sintetici privi degli acidi nucleici virali. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 24

La terapia genica mira a neutralizzare l’azione del gene malato. Questo può avvenire in vari modi: • sostituendo il gene malato con un gene sano; • aggiungendo un gene sano; • impedendo al gene malato di esprimersi. Esistono due tecniche per inserire un gene sano: • terapia ex vivo, in cui le cellule del paziente vengono estratte, coltivate in vitro, modificate e reintrotte; • terapia in vivo, in cui si introducono direttamente i geni corretti nelle cellule malate attraverso dei vettori. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 25

La terapia genica terapia ex vivo Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 terapia in vivo 26

Le cellule staminali Per la cura di malattie genetiche sono di notevole interesse le cellule staminali, che mantengono la possibilità di differenziarsi in molti tipi cellulari diversi. In laboratorio e possibile isolare cellule somatiche differenziate e riprogrammarle per farle tornare staminali. Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 27

FISSA I CONCETTI • Cosa sono i vaccini ricombinanti? • In quali modi la terapia genica può neutralizzare l’azione del gene malato? • Descrivi le differenze tra la terapia genica ex vivo e in vivo. • Cosa sono le cellule staminali e in quale campo vengono utilizzate? Curtis et al. , Invito alla biologia. azzurro © Zanichelli editore 2020 28