GVENL VE ETKN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111 546 ELEKTROFOREZ

GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111 -546 ELEKTROFOREZ Doç. Dr. Hilâl Özdağ

Elektroforez • Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek ayrıştırılması tekniğine elektroforez denir. • DNA, RNA ve Protein molekülleri ile yapılan çalışmaların öncelikle basamakları arasında yer alır.

Temel Kurallar • Jel tankında işlem yapmadan kapattığınızdan emin olun. • Yükleme ve yürütme yapmadan polimerleştiğinden emin olun. önce güç kaynağını jelinizin iyice • Neyi hangi sırayla yüklediğinizi hemen kaydedin: Bunun için yüklediğiniz örneklerin tüplerini tüplüğün üzerinde yükleme sırasıyla deney bitip siz bunların sırasını kaydedinceye dek muhafaza edin. • Et. Br veya toz akrilamid kalıntılarına karşı muhakkak eldiven giyin.

Temel Kurallar • Jelinizi erittikten sonra Et. Br ekleyin. Et. Br eklenmiş jel solüsyonunu eritip kaynatmayın. • Kullanılmış jelinizi jel tankının içinde bırakmayın. • Kullanılmış jelleri jel atık çöpüne atın. • Jel tankının içindeki tampon çözelti defalarca kullanılabilir. Ancak bu tamponun kullanım sıklığına bağlı olarak birkaç günde bir boşaltılıp karıştırılması ve buharlaşan kısmı kadarının taze tamponla doldurulması gerekir. • Jel tankının en az haftada bir boşaltılıp yıkanması ve distile sudan geçirilmesi tankın platin tellerinin uzun ömürlü olması açısından gereklidir. Zira yıkanmadığı takdirde zaman içinde tamponun için tuz platin teller üzerinde birikecektir.

Temel Kurallar • Jelinizi yürütmeye başlamadan önce kutupların doğru bağlandığından emin olun. • En doğrusu jeli yürütmeye başladıktan sonra 0. 5 -1 dak bekleyip yürümenin doğru yönde olduğundan, akımın geçtiğinden emin olmaktır.

Örnek hazırlama • Örnekler yükleme solüsyonu ile jele yüklenirler. • Yükleme solüsyonunun içinde örneğin kuyulara oturmasını sağlayan ağır bir molekül (sukroz, ficoll, gliserol) ile yürümeyi takip etmeyi mümkün kılan indikatör bir boya (BFB, XC) bulunur. • Yükleme solüsyonu saklanmalıdır. uzun dönem için -20 o. C’de bölünerek • Kullanımdaki yükleme solüsyonu oda ısısında kararlılığını uzun süre muhafaza edecektir.

Standartlar/Belirteçler • Moleküler ağırlık belirteçleri muhakkak jele dahil edilmelidir. • Bunların jele yüklenmesi hem jelin ve elektroforezin kalitesini standardize edecek hem de örneklerin yorumlanmasını mümkün kılacaktır. • Yüklenecek belirteç seçilmelidir. analiz edilecek örneklere uygun olarak • Moleküler ağırlık belirtecinin yürüme profili belirtecin kullanım kılavuzundan alınarak lab defterine, jel dokümantasyon sisteminin yanına konmalı, gerektiğinde kolayca kontrol edilebilmelidir. • Gerektiğinde ve mümkün olduğunda jele pozitif ve negatif kontroller yüklenmelidir.

Elektroforez Tipleri • Agaroz jeller genellikle yatay iken akrilamid jeller dikey olarak yürütülür. • Jeller farklı ebatta olabilir. Dizileme jelleri büyük olmak zorundadır ancak tarama ve transfer için kullanılan jeller mini veya midi boyutta tercih edilir. • Kapiller elektroforezde ince kapillerler için DNA, RNA, proteinleri otomatik olarak yüksek verimde ayrıştırılırlar. Ayrışma kromatografide olduğu gibi tespit ve analizle beraber gerçekleşir.

Jel Tipleri • Agaroz ve akrilamid her ikisi de porlu yapıdadır. Yüzdeleri ne kadar yüksekse por çapı o kadar küçülür. Gerekli ayarlamalar yapıldığında her ikisinde de DNA, RNA ve Protein incelenebilir. • Düşük konsantrasyondaki akrilamid jelleri manipüle etmek zordur. Düşük konsantrasyondaki agaroz jellerin manipülasyonu daha kolaydır. • Jel konsantrasyonunun ilgilen fragmentin boyutuna uygun olması gerekir. • Önceden dökülmüş hazır akrilamid jeller birçok firma tarafından üretilmektedir. Bu jeller buzdolabında aylarca bozulmadan kalabilir.

Yürütme Tamponları • Yürütme tamponları konsantre olarak (5 X veya 10 X) hazırlanır. 0. 5 X veya 1 X konsantrasyonda kullanılır. • Her tamponun belirli bir amperde belirli bir voltajı vardır. Kullandığınız tamponun özelliklerini farkedin, öğrenin ki problem oluştuğunda teşhis edin.

Güç Kaynağı • Güç kaynağının çıkışı sabit voltaj (m. V), sabit akım (amps) veya sabit güç (W) şeklinde olabilir. Birçok güç kaynağı modelinde bu modlar arasında otomatik değişimler mümkündür. • Her güç kaynağı sizin için uygun olmayabilir. Deneyiniz için gerekli olan amper veya voltu öğrenin ve buna uygun güç kaynağını seçin. • Dizileme jelleri yüksek wattlı, elektroforetik transferler yüksek akımlı ve agaroz veya akrilamid jel elektroforezleri geniş voltaj aralıklı güç kaynaklarına ihtiyaç duyar. • DNA, RNA ve protein jellerinde örnekler eksiden artıya yürürler. Eksi (katod) siyaha, artı (anod) kırmızıya bağlanmalıdır.

Güç Kaynağı • Güç kaynağının zaman ayarı varsa mutlaka kullanın yoksa jelinizi yürütmeye başladıktan sonra kronometrenizi ayarlayın. Özellikle küçük fragmentleri unutup fazla yürütüp jelden kaybetmeniz mümkündür. • Güç kaynağını kapatmadan jel tankına müdahale etmeyin!

Fiksasyon • Boyanacak jellerin boyamadan önce fikse edilmesi gerekmekdir. • Fiksasyon jellerin şişmesini denatürasyonunda da etkindir. engellediği gibi örneklerin

Kurutma • Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur. • Otoradyografide daha keskin bant verir. • Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)

Boyama • Agaroz jel içine Et. Br eklenerek DNA ve RNA jellerinin boyanması sağlanır. • DNA yürütülen poliakrilamid jelleri yürütme sonrasında jelin ebadına göre Et. BR veya gümüş nitrat ile boyanır. • Protein jelleri de elektroforez sonrası gümüş nitrat veya coomasie mavisi ile boyanır.

Belgeleme • Poloroid fotoğraf • Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir. • Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine alınabilir.

DNA Jelleri http: //a 32. lehman. cuny. edu/molbio_course/gelel. GIF

DNA Jelleri • 6 X yükleme solüsyonu: %30 (V/V) gliserol, %0. 25 (W/V) BFB, %0. 25 XC distile su içinde hazırlanır.

DNA Jelleri

DNA JELLERİ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici (Formaldehitli) ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici (Üreli) ØKapiller Elektroforez (CE) ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici

ELEKTROFOREZ ØElektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür. ØDenatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür. ØDenatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler. yapı

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici olmayan (Native) ØBüyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi) %0. 8 -1 arası jel hazırlanmalıdır. ØPCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2’lik jele ihtiyaç vardır. ØRFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10 -20 bç farklı fragmentleri ayırmak için Nu. Sieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir. Metaphor agaroz ile 3 -4 bç farkı ayırmak mümkündür.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØAgaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA) ile hazırlanır. ØDNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur. ØKısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØTBE 5 X veya 10 X konsantrasyonda hazırlanıp 1 X konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur. ØTAE 50 X konsantrasyonda hazırlanabilir. ØTAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin hazırlanması gerekmektedir. RNaz’sız ortama uygun şekilde

ELEKTROFOREZ ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi ØAkrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir. ØAPS her defasında taze hazırlanmalıdır.

ELEKTROFOREZ ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi ØAkrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir. ØAkrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir. ØAkrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19: 1/29: 1/39: 1 gibi ØMDE (Mutation Detection Enhancement) Jel

ELEKTROFOREZ ØKapiller Elektroforez ØDonmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır. Bu polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.

PROTEİN JELLERİ SDS-PAGE ØÖrneklerin içine 2 -mercaptoethanol veya dithiothreitol indirgeyici ajan olarak konulur. Böylece disülfid bağları indirgenmiş olur ve proteinler “random coil” konfigürasyonlarını koruyarak moleküler ağırlıklarına göre yürürler. Øİndirgeyici ajanların stokları çeker ocak altında açılıp çalışılır. ØYükleme solüsyonu -20 o. C’de saklanmalıdır. ØÖrnekler yüklenmeden önce 95 o. C’de ısıtılır veya kaynatılır. Örnekler kaynatıldıktan sonra buz üzerinde bekletilmelidir. ØKaynatılan tüplerin kapağı basınçla açılıp etrafa saçılabilir. Bunu önlemek için plastik kapak kilitleri kullanılmalıdır.

PROTEİN JELLERİ Standartlar ØStandartlar yüksek, düşük ve geniş aralıkta olabilir. Boyasız veya boyalı versiyonları mevcuttur. Boyalı olanlar daha kullanışlıdır. Aksi belirtilmediği sürece -20 o. C’de saklanmalıdır. ØGökkuşağı standartları çok kullanışlı ancak pahalıdır. ØBoyaları kovalent bağlı boyalar bantları göçlerinde varyasyon yaratabilir. Kesin moleküler ağırlık belirlenmesinde kalibre standartlar kullanılmalıdır.

MEMBRANA TRANSFER ØSouthern blot: Membran üzerindeki DNA ile problanır. ØNorthern blot: Membran üzerindeki RNA DNA veya RNA ile problanır. ØWestern blot: Membran üzerindeki protein antikor ile problanır. ØSouthwestern blot: Membran üzerindeki DNA protein ile problanır. ØMiddle eastern blot: Poli. U türevli membran m. RNA ile problanır.

MEMBRANA TRANSFER Kapiller Transfer

MEMBRANA TRANSFER Vakum Transfer

MEMBRANA TRANSFER Elektroforetik Transfer

MEMBRAN ØMembranlar rulo veya değişik ebatta kesilmiş olarak satılır. Tek boy jel kullanılmadığı sürece rulo olarak satın almakta fayda vardır. ØMembranlara çıplak elle asla dokunulmaz. ØMembranları almak için temiz bir forseps kullanmak gerekir. ØNaylon membran nükleik asit için en uygun olanıdır. Dayanıklıdır. Soyulup yeniden defalarca problanabilir. Yüksek konsantrasyonda bloklayıcı ajanla muamele etmek gerekir geriplan boyanmayı engellemek için. ØNitroselüloz bazı proteinler için en iyi seçimdir. Nükleik asitler elektroforetik olarak nitroselüloza transfer edilemezler.