Graduao em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II
Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Microrganismos na produção de vacinas Michele Pepe Cerqueira micpepe 2@yahoo. com. br 12 de abril de 2011
Conceito VACINA Produto biológico produzido pelo homem que contém um ou mais agentes imunizantes capazes de induzir uma resposta imune em indivíduos suscetíveis Aplicação “ A utilização de vacinas eficientes impede que um indivíduo seja acometido por uma determinada doença, além de ser o meio mais econômico para isso. Além disso, a vacinação beneficia também os indivíduos não imunizados”
Resultado Vacinas induzem proteção contra infecções estimulando o desenvolvimento de células efetoras e células de memória de vida longa Importância A imunização profilática utilizada em programas de vacinação no mundo levaram a erradicação completa ou quase completa de muitas doenças nos paises desenvolvidos
A erradicação da varíola pela vacinação. Janeway, 2010
Doença N° máximo de casos (ano) N° de casos 2004 Alteração percentual Difteria 206. 939 (1921) 0 -99, 99 Sarampo 894. 134 (1941) 37 -99, 99 Caxumba 152. 209 (1968) 236 -99, 90 Coqueluche 265. 269 (1934) 18. 957 -96, 84 Poliomielite 21. 269 (1952) 0 -100, 0 Rubéola 57. 686 (1969) 12 -99, 98 Tétano 1560 (1923) 26 -98, 33 Haemophilus influenza tipo B ~20. 000 (1984) 16 -99, 92 Hepatite B 26. 611 (1985) 6. 632 -75, 08 Abbas et al. , 2008
Por que não existem vacinas para todos agentes infecciosos importantes?
Doenças para as quais vacinas efetivas ainda são necessárias. Janeway, 2010
Vacinas são eficazes quando o agente infeccioso: Não estabelece latência Não sofre muito ou nenhuma variação antigênica Não interfere com a resposta imunológica do hospedeiro Ex: HIV
Critérios para uma vacina efetiva
Tipos de vacina ü Atenuada ou replicante ü Inativada ou morta ü Subunidade Biotecnologia convencional ü Conjugadas ü Recombinante Biotecnologia moderna “DNA recombinante”
Exemplos de vacinas Tipo de vacina Exemplos Bactérias vivas atenuadas ou mortas BCG, cólera Vírus atenuados vivos Pólio, raiva Vacinas de subunidades (antígenos) Toxóide tetânico, toxóide diftérico Vacinas conjugadas Haemophilus influenzae, pneumococo Vacinas sintéticas Hepatite (proteínas recombinantes) Vetores virais Experiências clínicas de antígenos HIV em vetor canaripox Vacinas de DNA Experiências clínicas em andamento para várias infecções
Tipos mais comuns de vacinas bacterianas Proteção contra Coqueluche (pertussis) Cólera Febre tifóide Tuberculose Difteria Tétano MO empregado no Composição básica preparo da vacina Bordetella pertussis MO inativado Vibrio chlorea MO inativado ou atenuado Salmonella typhi MO inativado Mycobacterium bovis MO atenuado Corynebacterium Exotoxina inativada diphteriae (toxóide) Clostridium tetani Exotoxina inativada (toxóide) Meningite meningocócica C Neisseria meningitidis Polissacarídeos capsulares Meningite meningocócica B Neisseria meningitidis (Sorogrupo b) Proteínas de membrana externa Peste Yersinia pestis MO inativado (Sorogrupo C)
Tipos mais comuns de vacinas virais MO empregado no preparo Composição básica da vacina Proteção contra Gênero Família Poliomielite Poliovirus Picornaviridae Vírus inativado (Salk) Vírus atenuado (Sabin) Varíola Poxvirus Poxviridae Vírus atenuado Raiva Lyssavirus Rhabdoviridae Vírus inativado Rubéola Rubivirus Togaviridae Vírus atenuado Influenzavirus Orthomyxoviridae Vírus vivo ou inativado Sarampo Morbillivirus Paramyxoviridae Vírus atenuado Caxumba Paramyxovirus - Vírus atenuado Febre amarela Flavivirus Togaviridae Vírus atenuado
Vacinas atenuadas e inativadas ü Inativação: leva o microrganismo a incapacidade de replicação ü Atenuação: promove a perda da capacidade patogênica, mas mantém imunogenicidade ü Vacinas bacterianas atenuadas: induzem proteção limitada, eficazes apenas por curto prazo ü Vacinas virais atenuadas: induzem especifica de longa duração, dose única imunidade
Atenuação Metodologia tradicional
Atenuação Metodologia do DNA recombinante
Inativação ü Métodos físicos ücalor üultravioleta ü Métodos químicos üFormaldeído üAgentes alquilantes (β-propiolactona, etieneimina) Ligam cruzadamente as cadeias de ácido nucléico
Vacina de subunidade ü Usa somente fragmentos antigênicos ou produtos de um microrganismos üMaior imunogenicidade ü Normalmente administrado com adjuvantes ü Toxóides: toxina bacteriana atenuada, que se tornam inócuas, mas permanecem imunogênicas
Vantagens e desvantagens
Vacinas recombinantes ü Produzidas recombinante mediante tecnologia de DNA ü Tipos: Subunidade, Vetorizada ou Gênica (DNA) ü Para humanos: Hepatite B, HPV ü Para animais: Raiva (vaccinia virus), Leucemia felina (canarypox virus), Doença de Marek e Doença de Newcastle (herpesvírus de peru), Cinomose, Leishmaniose. . .
Vacinas de subunidade
Recombinant clones Mais de 120 produtos terapêuticos recombinantes
Vacinas vetorizadas
Vacinas gênicas (DNA)
Produção de vacinas I. Seleção de cepas ou antígenos II. Preservação de cepas III. Multiplicação IV. Purificação V. Inativação ou atenuação
1. Seleção de cepas ou antígenos Sorotipos Vírus da febre aftosa: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 e Ásia-1 Streptococcus pneumoniae: + 90 (4, 6 B, 9 V, 14, 18 C, 19 F e 23 F)
PROJEÇÕES: CORONA Antígenos víricos : envelope PROJEÇÕES: HEMAGLUTININAS ENVELOPE: GLICO/LIPO/ PROTEINAS NÚCLEOCAPSÍDEO
Antígenos bacterianos FLAGELOS PILI CÁPSULA MEMBRANA CELULAR PAREDE CELULAR RIBONUCLEOPROTEINAS Enzimas Celulares
2. Preservação de cepas Liofilização Ultrafreezer -80 Nitrogênio líquido -196
3. Multiplicação - Conhecimento das características biológicas do MO - Meios de cultivo (25 a 3500 L) - Fermentação (bioreatores); ampliação de escala (scale up)
Relação volume meio – capacidade do frasco 0, 2 (20%) Inóculo – 5 a 10%
Cultivo celular Estático Homogênio Ovos entre 7 a 19 dias
Células renais de bovino – cultivo primário Efeito citopático – 30 h Efeito citopático – 48 h
4. Purificação
4. Purificação Centrífugas
4. Purificação Cromatografia
Processo de produção da vacina da coqueluche ü Bacilo gram-negativo Bordetella pertussis ü Etapas üPreparo do inóculo, üFermentação, üFiltração, üDestoxificação ü Suspensão do MO liofilizado em soro fisiológico cultivo em Bordet-Gengou (35°C, 96 h) ü Recultivo em Bordet-Gengou (35°C, 48 h)
Processo de produção da vacina da coqueluche ü Pré-inóculo ü Duas etapas de cultivo em meio de Stainer-Scholte (24 hs, 35°C) ü Fermentação ü Relação entre volume do inóculo e volume do meio é de 5% ü Filtração ü Separação das bactérias do meio e ressuspender em soro fisiológico
Processo de produção da vacina da coqueluche ü Destoxificação ü Através do uso de formaldeido, conservação com mertiolato, em tanques de 2 a 8°C ü Mistura com toxóide diftérico (vacina conjugada) ü Provas para liberação final da vacina ü Toxidez ü Potência em camundongos
Controle de vacinas ü Inocuidade ü Pureza ü Esterilidade ü Eficácia üsorologia üdesafio
Vacina Ideal ü Baixo Custo ü Fácil estocagem (Temp. ambiente) ü Dose única ü Proteção duradoura
ETAPAS DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE VACINAS ~= Descoberta Estudos Experimentais -1 - -2 - Estudos Clínicos -3 - Scale-up -4 - 10 -20 anos Estudos Clínicos Fase I -5 - Estudos Clínicos Fase II -6 - Estudos Clínicos Fase III -7 - Registro -8 - Produto -9 - Fase IV Características: multidisciplinar; longo período de maturação; alto risco de investimento. - 10 -
Periódicos
Calendário básico de vacinação da criança
Calendário básico de vacinação da criança
Trabalho sobre vacina ü Trabalho individual ü Escolher um artigo – desenvolvimento de novas vacinas ou otimização de vacinas comerciais ü Relatar o papel da biotecnologia nesse artigo escolhido ü Enviar por e-mail o trabalho e o artigo escolhido – data: 15/04/2011 micpepe 2@yahoo. com. br
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