Graduao em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II

Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio. rochedo@ufpel. edu. br 06 de abril de 2010

DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? § Estudos bioquímicos § Determinação da estrutura 3 D § Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico. . . Alternativa para as seguintes limitações: § Quantidade § Dificuldade de purificação a partir do tecido original § Contaminação (príons, vírus, oncogenes. . . ) § Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas § Processo completamente controlado § Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

Produção de proteínas recombinantes em bactérias Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

Engenharia genética X expressão heteróloga 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparo do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

Vetores de Expressão • Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG • Sítio de múltipla clonagem (polylinker) • Promotores induzíveis (controle da expressão) • Sinais de secreção • Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)

Vetor de expressão em E. coli RBS ou sequência de Shine Dalgarno

Regulação da expressão gênica – controle da expressão Operon Lac

Vetores da família p. ET (Novagen) • • Altos níveis de expressão Promotor T 7 é mais forte que o lac Controle rigoroso pelo lac. O Necessita de cepa de E. coli especial – BL 21(DE 3) IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE não induzidas Proteína recombinante de 70 k. Da induzidas com IPTG

Produção de proteínas recombinantes em bactérias (sistema p. ET)

Vetor de expressão com cauda de histidina

Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose -Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

-Minimizar a proteólise -Maximizar a expressão -Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) -Facilitar o folding -Solubilidade

Algumas companhias que comercializam vetores de expressão http: //www. promega. com http: //www. neb. com http: //www. stratagene. com http: //www. invitrogen. com

Produção de insulina recombinante (Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation) § Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos; § Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais; § Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes. Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana Seq sinal Peptídeo C Cadeia α Preproinsulina Clivagem da sequência sinal de secreção Cadeia α Ligações dissulfeto Cadeia β Peptídeo C Cadeia α Clivagem do peptídeo C Insulina funcinal Proinsulina

Obtenção de insulina recombinante

Algumas proteínas recombinantes disponíveis para terapia humana § Insulina (rh. I); § Hormônio do crescimento (rh. GH); § Hormônio folículo estimulante (rh. FSH); § Fator VIII (rh. Factor. VIII); § Eritropoetina (EPO); § Fator estimulante de colônias de granulócitos (rh. G-CSF); § N-acetilgalactosamina-4 -sulfatase (rh. ASB); § DNAse § Ativador do plasminogênio tecidual (rh. TPA); § Glicocerebrosidase (rh. GBA); § Interferon-alfa, -beta e gama (rh. IFN-alpha, -beta e -gama); § Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli Vantagens Desvantagens Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Trabalho complementar * Formar grupos com 4 componentes * Buscar no Pub. Med artigo científico relacionado a expressão de proteína heteróloga em E. coli * Entregar até 12 -04 -10 - Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante