Gnsebszet Cseh Zsfia A c DNS trak Plazmidba
Génsebészet Cseh Zsófia
A c. DNS tárak Plazmidba: 5 kbp DNS, a gamma fágba: 20 kbp DNS klónozható. (Az átlagos baktérium 1 kbp hosszú. ) Genom kis része: gének Genom nagy része: intergénikus DNS-szakaszok Nem íródik át: n intergénikus, n promóter, n intron szekvenciák
A c. DNS tárak Def. : Különféle c. DNS-eket vagy c. DNSszakaszokat tartalmazó vektorok összessége. Készítése: 1. ) Reverz transzkriptáz enzim az m. RNS alapján komplementer szálat szintetizál complementer DNS= c. DNS 2. ) A teljes c. DNS-t vagy annak egyes szakaszait vektorokba klónozzák.
Géntárak Olyan vektorok gyűjteménye, amelyek bár kis szakaszokban, de valamely faj teljes genomját tartalmazzák. Vektor: fágok és plazmidok (bakteriális), olyan DNS molekulák, amelyek alkalmasak idegen eredetű DNS szakaszok megsokszorozására. A genomikus géntárat alkotó rövid DNS-szakaszok bármelyike izolálható, és belőle tetszőleges mennyiségű DNS készíthető, használható különböző célokra.
Géntárak A génkönyvtárból ki kell tudni választani azt a klónt, amelyre szükség van. n A kiválasztott klón szaporítható, majd kinyerhető belőle a nagy mennyiségű, klónozott DNS. n
Géntárak szűrése 1) Idegen DNS-t tartalmazó baktériumkolóniát készítenek. 2) A kolóniából baktériumokat visznek egy nitrocellulóz filterre. 3) A nitrocellulóz filtert Na. OH-al kezelik baktériumok feltárása DNS denaturálása egyszálú DNS kötése a filterhez
Géntárak 4) A DNS-t 90 -95 C 0 -on rásütik a filterre, hogy a DNS ne vesszen el 5) A filtert 32 P-vel jelölt próbával inkubálják (vagy fluoreszcens molekulákkal). 6) Inkubáció alatt a próba DNS hibridizál a komplementer DNS-szekvenciákkal.
Géntárak 7) A nitrocellulóz filtert röntgenfilmmel borítják, így a 32 P bomlása során létrejövő béta-sugárzás hatására fotokémiai reakció játszódik le a filmben. fekete ezüstszemcsék jelennek meg a film előhívása során. 8) A szemcsék megmutatják, hogy melyik kolónia tartalmazza a próbával komplementer DNSszakaszt. 9) A megfelelő baktériumok az eredeti mesterlemezről izolálhatók, elszaporíthatók.
PCR (polimerase chain reaction) 10 -12 kbp hosszú DNS-szakaszok nagy mennyiségű, in vitro elkészítését teszi lehetővé. Eppendorf-csőbe teszünk: n Puffer n Primerek n Taq-polimeráz enzim n d. ATP, d. TTP, d. GTP, d. CTP
PCR Primer: 20 -30 pb-ból álló egyszálú, szintetikus oligonukleotid, amely komplementer a templát DNS valamely szakaszával. PCR: Három különböző hőmérsékleten történő folymat ismétlődése.
PCR 95 C 0 DNS denaturálódása 60 C 0 primerek kapcsolódása a komplementer DNSszekvenciákkal. 72 C 0 Taq-pol optimális működési hőmérséklete, komplementer DNS szintézise a primertől kiindulva. Exponenciális növekedés: 1 ciklus DNS kettős spirálok száma megkétszereződik: n db ciklus 2 n DNS-spirál (30 -40 ciklus)
PCR Primer: Olyan rövid szekvenciák, amelyek a sokszorozni kívánt DNS két végével komplementerek és 3’ végük egymás felé néz. Azonos olvadási hőmérséklettel kell rendelkezniük és feltétel, hogy nagy fölöslegben kell legyenek.
PCR Taq polimeráz Működési optimuma: 72 C 0 Nem károsodik 95 C 0 -on
PCR Denaturálás 95 C 0 DNS kettős szála felbomlik egyszálú DNS
PCR Túlnyúló végek a ligáláshoz
PCR
PCR
PCR RT-PCR: Az m. RNS minták alapján először a reverz transzkriptáz enzim szintetizál az m. RNS-nek megfelelő DNS-t, majd a kapott DNS –szakasz elszaporíthatő a megfelelő primerekkel.
RFLP Restrikciós enzim: meghatározott szekvenciát ismer fel és vágja el ennek mentén a DNS-t restrikciós fragmentek képződnek. Restrikciós fragment: hossza egyenlő restrikciós helyek egymástól mért fizikai távolságával. Elkülönítésük: gélelektroforézissel A hosszabb fragmentek rövidebb utat, a rövidebb fragmentek hosszabb utat tesznek meg. Az azonos hosszúak egy sávot képeznek. A sávok helyzete fordítottan arányos a restrikciós fragmentek hosszának logaritmusával.
RFLP (restrikciós fragment hosz polimorfizmus) n Gélelektroforézis:
RFLP Sávok láthatóvá tétele: 1)DNS-hez kapcsolódó festékkel: etidium-bromid UV-fényben narancssárgán fluorszkál. 2) DNS/DNS vagy DNS/RNS hibridek kimutatásával, jelzett próbával való hibridizáció útján.
RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfizmus) A populációban sok génnek sok allélja létezhet egyidejűleg a populáció az adott tulajdonságot illetően polimorf. A mutációk restrikciós helyeket szüntetnek meg és újakat hoznak létre, megteremtve a DNS polimorfizmus alapját.
RFLP Tkp a DNS polimorfizmusa valamely restrikciós hely meglétét vagy hiányát jelenti a DNS ugyanazon szakaszán a homológ krsz-ák DNS-ében. Ez azt jelenti, hogy a faj különböző egyedeiből származó homológ krsz -ák DNS-ének adott pontján valamely restrikciós hely jelen van-e vagy sem. Valamely restrikciós enzimmel folytatott emésztés során eltérő hosszúságú restrikciós fragmentek képződnek. A különféle hosszúságú restrikciós fragmentek eltérő gyakorisággal lehetnek jelen a különböző
RFLP Minden ember genetikailag egyedi kombináció, egyedi RFLP-mintázat jellemző minden egyes emberre személyek azonosítása. Alkalmas módszer a a krsz-ák jól definiált pontjainak azonosítására. A marker mutációk géneket azonosítanak, viszont az intergénikus szakaszok is bőségesen tartalmaznak restrikciós helyeket.
RFLP Alkalmas: n Genetikai eredetű tulajdonságok vizsgálata n Prenatális diagnosztika n Személyek azonosítása n Tájékozódási pontok a krsz-ák mentén
Restrikciós endonukleázok Restrikciós enzimek: azon baktériumok után nevezik el, amelyekből izolálják őket. Pl. : • Eco. RI (Escherichia coli RY 13) • Eco. RV az (Escherichia coli R)
Restrikciós endonukleázok A baktériumokban kifejlődött restrikciósmodifikációs rendszer felfedezése tette lehetővé az irányított, reprodukálható, in vitro DNS szabás -varrást és a technikán alapuló DNS-klónozást. A restrikciós-modifikációs rendszer két különböző enzimaktivitáson alapszik.
Restrikciós endonukleázok: A restrikciós enzimek meghatározott sorrendű bázispárokból álló egységet (palindrom szekvenciák) ismernek fel a DNS-spirál kettős spirálon és a felismerő helyen, vagy annak közelében hasítani képesek a kettősláncú DNS molekulát. A "restrikciós" szó ezen enzimcsoport nevében a baktériumban betöltött szerepükre utal: a restrikciós enzimek feldaraboljak a gazdasejtbe bejutó idegen DNS-t (pl. bakteriofág DNS-e), "restriktív" körülményeket teremtve számukra.
Restrikciós endonukleázok DNS metilázok: Metil-csoportokkal jelölik meg a baktériumok saját DNS-ét a baktérium restrikciós endonukleáza által felismert szekvenciánál. A módosítás lehetetlenné teszi az endonukleázok működését, "védik" a DNS molekulát. A baktériumokba bejutott idegen DNS molekula viszont nincs a megfelelő helyen metilálva, és áldozatul esik az endonukleázoknak.
Restrikciós endonukleázok A génmanipulációs kísérletekben olyan restrikciós endonukleázokat használnak, amelyek reprodukálhatóan, a felismerőhelyen belül hasítanak. Ezek az enzimek 4 -8 bp méretű specifikus szekvenciákat ismernek fel (restrikciós helyek), amelyek palindromok: 5'-3' irányban mindkét szálon ugyanaz a bázisok sorrendje.
Restrikciós endonukleázok A restrikciós enzimek egy része úgy vágja a DNS-t, hogy rövid, egyszálú, komplementer végek keletkeznek a hasítás helyen. Ezek a "ragadós" végek nagy szerepet játszanak a rekombináns DNS-technikákban, mert könnyen újra összetapadnak ugyanazon vagy más DNSdarabok ugyanolyan ragadós végeivel. A párosodott szekvenciák a DNS-ligáz nevű enzim segítségével stabilan összekötik a két DNSfragmentet.
Restrikciós endonukleázok A restrikciós enzimek másik csoportja a DNS-t a felismert szekvencia középpontjában vágja, így „tompa” végek keletkeznek, amelyek - miután hiányoznak az összekapcsolódást megkönnyítő túlnyúló komplementer szálak - igen nehezen tapadnak újra össze. Előnyük azonban, hogy ebben az esetben csak annyi szükséges az összekapcsolódáshoz, hogy mindkét vég „tompa” legyen.
Restrikciós endonukleázok TOMPA VÉG RAGADÓS VÉG
Restrikciós (=fizikai térképek) Def. : Olyan ábrázolásmód, amely megmutatja a különféle restrikciós enzimek hasítési helyei milyen sorrendben követik egymást a DNS mentén. Készítése során egy adott DNS-szakaszt különféle restrikciós enzimekkel emésztenek külön-külön és együtt is. Az emésztés során képződő fragmenteket elkülönítik, meghatározzák a fragmentek méretét. Méret alapján a fragmenteket sorrendbe rendezik térkép
Restrikciós (=fizikai térképek) A restrikciós helyek helyzete, egymástól mért távolsága arányos az emésztés során képződő fragmentek hosszával, a DNS-t alkotó bp-ok hosszával. Nemcsak gének térképezését, hanem molekuláris klónozásukat is lehetővé teszik.
Southern blott Def. : Fragmentek detektálása jelzett DNS-próbával. 1) Nitrocellulóz (vagy nylon) filterre blottolják a gélelektroforézissel elkülönített fragmenteket. Blottolás= gélből a filterre szívják a DNSfragmentet. 2) Na. OH-kezelés 3) 10 min 90 -95 C 0 denaturáció 4) Egyszálú DNS filterre kötése
Southern blott 5) 32 P próbával (vagy fluoreszkáló molekulákkal) inkubálás (komplementer az egyszálú DNS-sel) 6) Mosás (nem hibridizált DNS eltávolítása) 7) Röntgenfilm készítése 32 P elbomlik radioaktiv béta-sugárzás fekete ezüstszemcsékként látszik a filmen.
Northern blott RNS molekulák elkülönítése, izolálás, gélelektroforézis, nitrocellulóz szűrő, sütés. DNS próbával kimutathatóak azok, amelyek hibridizáltak a a DNS-próbával.
Western blott
Western blott Fehérjemolekulák elkülönítésére használatos technika, elve ua. , mint a Northern blottolásé, itt azonban specifikus ellenanyaggal kezelt DNS-próbával detektálják és teszik láthatóvá a keresett fehérjemolekulát.
FISH(fluoreszcens in situ hibridizáció) Specifikus kromoszómális DNS-szakaszt láthatóvá tevő technika. A komplementer nukleinsav szekvenciák akkor is hibridizálnak egymással, ha az egyik DNS-fonal egy krsz része. A hibrid molekula FISH módszerrel láthatóvá tehető, és mikroszkópban tanulmányozható. A hibrid szakasz kimutatása különleges erősítést igényel, hogy tanulmányozható legyen. immunglobulin-GFP DIG
FISH DIG (=digoxigén): DNS próbát megjelöljük ezzel, a próbát a DIG-en keresztül egy elsődleges ellenanyag ismeri fel. Ez az ellenanyag a DIG-gel specifikusan reagál. Az elsődleges ellenanyag molekulái másodlagos ellenanyaggal kapcsolódnak, amelyek fluoreszcens anyaggal jelzettek.
FISH A próba-DNS sok DIG-et tartalmaz, és a DNS hibrid több elsődleges ellenanyaggal kapcsolódik, amely elsődleges ellenanyag több másodlagos ellenanyaggal kapcsolódik. A másodlagos ellenanyag sok floureszcens anyaggal van megjelölve szendvics szerkezet: kellő intenzitással fluoreszkál, amely fluoreszcens mikroszkópban tanulmányozható.
FISH
FISH
VNTR Eukromatinban: a rövid DNS szekvenciák tandem módon ismétlődve vannak elrendeződve. VNTR: mérsékelten repetitív szekvencia osztályába tartozik. Ismétlődő szekvencia: = mikroszatellit vagy VNTR (variable number of tandem repeats) Az egyes kópiák száma a VNTR-blokkokban és az egyes emberekben is különbözőek Igazságügyi orvostanban személyes azonosítására használják.
VNTR
VNTR analízis
VNTR analízis 1) VNTR amplifikálása PCR módszerrel (apai és anyai eredetű krszból származó DNS alapján). A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a VNTR szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: n n a VNTR-ben ismétlődő „egység” hosszától a kópiák számától. 2) Gélelektroforézis Az „egység” DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete lapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázat képződik. Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető a VNTR analízis.
- Slides: 49