Gnie Gntique L 3 Biochimie Gnie Gntique Introduction
Génie Génétique L 3 Biochimie
Génie Génétique Introduction: • Le génie génétique (ou ingénierie génétique) est un ensemble de techniques, faisant partie de la biologie moléculaire et ayant pour objet l’utilisation des connaissances acquises en génétique pour utiliser, reproduire, ou modifier le génome des êtres vivants. • Il a pour but la modification des génotypes, et donc des phénotypes. • Les applications possibles génie génétique sont multiples: – En santé humaine (correction d’un gène porteur d’une mutation délétère, production de protéines thérapeutiques, vaccins, etc. ) – En agriculture biotechnologique (mise au point de nouvelles générations de plantes génétiquement modifiées, etc. ) – La mise au point d’outils destinés à la recherche (par exemple pour explorer la fonction d’un gène).
Le dogme central de la biologie moléculaire • En 1958 Francis Crick propose le dogme central de la biologie moléculaire qui explique la circulation de l'information génétique de l'ADN à l’ARN , pour obtenir un produit fonctionnel, une protéine. • Ce dogme est bel et bien confirmé par des chercheurs plus tard
MATÉRIEL GÉNÉTIQUE • Ce dogme est bel et bien confirmé par des chercheurs plus tard • Donc > le matériel génétique se compose d’ADN et d’ARN
Génie Génétique L’ADN chez les eucaryotes Introduction:
Génie Génétique L’ADN chez les procaryotes Génome bactérien: Le chromosome • 1. Longueur: de 105 à 107 • 4. Informations dans le paires de bases. La longueur génome: du génome de E. coli = 1. 6 mm. – Contiennent beaucoup moins de gènes que les génomes eucaryotes • 2. Génome haploïde: 1 seule copie de chaque chromosome par bactérie – La quasi-totalité génome bactérien est codant ! • • 3. Organisation structurale: le chromosome bactérien est souvent circulaire et présent dans le nucléoide plasmides chromosome 6
Génie Génétique L’ADN chez les procaryotes Génome bactérien: Les plasmides • • • Fragments d’ADN double brin Circulaires Intra cytoplasmiques Auto réplicatifs Portent des gènes de « survie » – Adaptation à l’environnement • Résistance aux antibiotiques +++ chromosome plasmides 7
Nature chimique du matériel L’ADN: génétique -L'ADN est un polymère. -Le monomère d'ADN est appelée un nucléotide. -Les Nucléotides sont reliés entre eux par des liaisons phospho-diestères pour former les côtés de la molécule d'ADN.
Nature chimique du matériel génétique De la base au nucléotide Désoxyribonucléotide: -Un groupe phosphate attaché au carbone 5 du désoxyribose (sucre) et une base azotée fixée au carbone 1 dans le sucre.
Nature chimique du matériel génétique Les bases de l’ADN et de l’ARN Le thymine est remplacé par l’uracil en ARN
1. Nature chimique du matériel génétique Les sucres de l’ADN et de l’ARN - Connaître la numérotation des carbones (3’ à 5’)! - Dans l’ADN l’évolution a sélectionné le désoxyribose pour transmettre l’information - Dans l’ARN c’est le ribose
Nature chimique du matériel génétique L’ADN - L'ADN a la forme d'une double hélice. -Les côtés sont antiparallèles. - Souvent, les molécules sont linéaires et possèdent donc une extrémité 5’phosphorylée et une extrémité 3’hydroxylée
1. Nature chimique du matériel génétique L’ADN - La structure secondaire des acides nucléiques est imposée par l’appariement des bases c’est-à- dire la formation de liaisons hydrogène entre deux bases organiques. - Adénine est liée avec la thymine en utilisant 2 liaisons hydrogène. (A-T) - Guanine est liée avec Cytosine en utilisant 3 liaisons hydrogène. (G-C)
SYNTHESE DE L’ ADN P P CH 2 Base O 5' CH 2 P Base O P CH 2 O Base CH 2 Base O H 20 + 3' P réaction de Synthèse P 5' CH 2 3' OH P P OH P produit O CH 2 O Base OH 3' P Base
Synthèse Protéique : de l'ADN à la protéine La transcription
La Transcription est Importante transcription (maturation de ARN) r. ARNs m. RNAs traduction proteins sn. ARNs t. ARNs autres ARNs non-codant (e. g. ARN des telomerases)
La transcription Les protéines sont différemment exprimées • Les gènes s'expriment plus ou moins : le gène A s'exprime beaucoup plus que le gène B
La transcription chez les procaryotes
Structure typique d’un gène procaryote Promoteur d’un gène : -35 -10 +1 Phase ouverte de lecture +1 : Démarrage de la transcription Boite -35 5’-TTGACA-3’ Boite -10 (Pribnow box) 5’-TATAAT-3’ Souvent pas d’introns chez les procaryotes
Particularité de la transcription procaryote Couplage avec la traduction
Particularité de la transcription procaryote Transcription (ARN) polycistronique
La transcription chez les eucaryotes
La transcription Structure typique d’un gène eucaryote Régulation de la transcription : présence sur l ’ADN de séquences régulatrices
La transcription chez les eucaryotes ARN polymérase se fixe à l’ADN au niveau d’une courte séquence d'ADN placée juste avant le début du gène = promoteur Le promoteur indique: • Le début du gène à transcrire en ARNm (où l’ARN polymérase et les facteurs de ranscripions doivent se fixer sur l’ADN) • Quel brin d’ADN doit être transcrit
Maturation de l’ARNm
Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription Maturation des ARN 1. Modification des extrémités Extrémité 5 ’ : addition du chapeau “ Cap” Extrémité 3 ’ : queue poly (A) ARN + n ATP ARN-(AMP)n + n. PPi Polyadénylate polymérase Signification biologique: -liaison du m. RNA au ribosome -protection du m. RNA
Enzymes pour le Capping de ARN: • Phosphatase • Guanyl transferase – ajout d’un GMP en liaison 5’ à 5’ • methyltransferase
Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription L’extrémité 3 'est également traitée: - Une enzyme coupe en aval du site de polyadénylation (région AAUAAA) - Site de Clivage (CA) – environ 10 -30 nucléotides en aval d la région AAUAAA - La polymerase Poly A (PAP) ajoute 100 à 200 ATPs - La longueur de la queue poly A influence la demivie (taux de dégradation)
Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription 2. Excision-Epissage: Exons et Introns l La plupart des gènes eucaryotes contiennent des séquences non codantes appelées introns qui interrompent les séquences codantes pour les exons. l Les introns sont excisés de l'ARN avant leur transport vers le cytoplasme. l Les introns de pré-ARNm sont excisés par des structures ribonucléoprotéines complexes appelées spliceosomes.
Spliceosome
Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription ARNm Mature Modifications post-traductionnelles
La transcription chez les eucaryotes -- L’épissage altératif
La transcription Eucaryotes vs Procaryotes Schéma simplifié
Traduction • C’est le mécanisme par lequel le flux d’information va passer de la forme acide nucléique (alphabet à 4 lettres) à la forme protéine (alphabet à 20 lettres) selon un code universel ou presque (code génétique). • La traduction consiste à faire correspondre la séquence nucléotidique de l'ARNm à la séquence d'acides aminés de la protéine.
La traduction Elle se déroulent dans le cytoplasme de la cellule Polypeptide en cours de synthèse Sens de déplacement du ribosome
Chapitre I: Outils enzymatiques de génie génétique
Outils enzymatiques de génie génétique • Ces enzymes sont des protéines qui servent d'outils pour manipuler les acides nucléiques. • Elles sont très présentes lors de la réplication du matériel génétique, de la transcription, de la traduction et même de la réparation de l'ADN. • Elles représentent une bonne part des outils de base pour le biologiste moléculaire et de génie génétique.
Outils enzymatiques de génie génétique • Des enzymes qui coupent les acides nucléiques • Des enzymes qui collent des bouts d'ADN ensemble • Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • Des enzymes qui recopient les acides nucléiques • Des enzymes qui modifient l’ADN
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les nucleases • Nucléases hydrolysent une liaison ester au (a) sein d'une liaison phosphodiester. (b) (a 1) (a 2) (c) une nuclease (a). une endonucléase (b) et une exonucléase (c)
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les nucleases • Endonucléases: nucleases qui clivent les liaisons phosphodiester dans une chaîne d'acide nucléique. • Elles peuvent être spécifiques pour l'ARN ou ADN simple brin ou double brin. • Exonucléases: nucleases qui clivent les liaisons phosphodiester une à la fois à partir de l'extrémité d'une chaîne polynucléotidique. • Elles peuvent être spécifiques pour l'extrémité 5 'ou 3' de l'ADN ou de l'ARN.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les nucleases – Endonucleases • Enzymes de Restriction : trois types • Deoxyrebinucleases (DNase) – DNase I – Nuclease S 1 et Mung Bean Nuclease • Ribonucleases (RNase) – RNase. A et RNase H… – Exonucleases • Exonuclease III • Exonucléase de phage λ • Exonuclease Bal 31
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Les enzymes de restriction: • Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries et constituent un mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Les enzymes de restriction: • Ciseaux moléculaires qui coupent molécules d'ADN double brin à des points spécifiques (4à 8 pb) non methylés. • Trouvées naturellement dans une large variété de procaryotes • Un outil important pour la manipulation de l'ADN.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Types des enzymes de restriction: – Enzymes de type I : Elles reconnaissent le site de restriction sur l'ADN et coupent la molécule très loin au-delà de ce site. Environ 1000 à 5000 nucléotides au-delà. La coupure est assez aléatoire : enzyme inutile en biologie moléculaire. – Enzyme de type II : Elles reconnaissent le site de restriction et coupe à cet endroit. Très utilisés en génie génétique. – Enzyme de type III: Elles reconnaissent le site de restriction et coupe une vingtaine de nucléotides plus loin.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Les enzymes de restriction: Type II Enzyme de Restriction coupe le Squelette de sucre-phosphate. Site de Restriction a) Extrémités cohésives (5’ Sortante) b) Extrémités franches c) Extrémités cohésives (3’ Sortante)
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Nomenclature des enzymes de restriction: – Dérivé du nom d’espèce ou de variété de la bactérie qui la produit. On écrit l’initiale du nom du genre, les deux initiales du nom de l’espèce, 1 lettre ou 1 nombre pour désigner la variété (ou souche) et après un espace un chiffre romain pour désigner successivement les différentes enzymes de restriction obtenues à partir de la même souche.
Enzyme Source Site de restriction Coupure Extrémités (après coupure) Eco RI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5‘ Cohésives Bam. HI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' Cohésives Hind. III Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' Cohésives Taq. I Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' Cohésives Not. I Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'--GC GGCCGC--3' 3'—CGCCGG CG--5' Cohésives Alu. I Arthrobacter luteus 5'AGCT 3'TCGA 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' Franches Bg. IIII Bacillus globigii 5'AGATCT 3'TCTAGA 5'---A GATCT---3' 3'---TCTAG A---5' Cohésives Hae. III Haemophilus aegyptius 5'GGCC 3'CCGG 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' Franches Hha. I Haemophilus haemolyticus 5'GCGC 3'CGCG 5'---GCG C---3' 3'---C GCG---5' Cohésives Pst. I Providencia stuartii 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' Cohésives Sma. I Serratia marcescens 5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' Franches
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Utilisation en RFLP – L’analyse de la longueur des fragments de restriction, (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des techniques d’analyse de la séquence primaire de l’ADN à la recherche de substitutions, d’insertions ou de délétions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur des fragments de restriction.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Utilisation en RFLP : • Les SNP (Single nucleotide polymorphisms) sont des marqueurs génétiques utiles. Ce sont des sites à une seule paire de base qui varient dans une population • Lorsqu'une enzyme de restriction est ajoutée, les SNPs donnent des fragments d'ADN de longueurs différentes • Une carte de restriction peut être générée en utilisant les chevauchements entre les fragments générés par des enzymes de restriction différentes.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases • Utilisation en RFLP : • Dans l'analyse des fragments de restriction, les fragments d'ADN produits par digestion par une enzyme de restriction d'une molécule d'ADN sont triés par électrophorèse sur gel • L’électrophorèse utilise un gel comme tamis moléculaire pour séparer les acides nucléiques chargés négativement selon leurs tailles • Un courant électrique est appliqué qui provoque les molécules chargées à se déplacer à travers le gel • Les molécules sont triées en «bandes» par leur taille
DNA T Allele normal SNP C Allele morbide
TECHNIQUE Mélange de molécules d'ADN de tailles différentes Source d'énergie Anode + – Cathode Gel 1 Gèl d’agarose + BET (bromure d’ethedium) qui est un intercalent Le BET peut etre excité par les UV Source d'énergie – + molécules Plus longues 2 Molécules plus courtes
RESULTS Révélation des bandes par excitation aux rayons UV (ultra violet)
RFLP et Révélation des produits par électrophorèse: exemple Allele allele Morbide Cellule normale (cellule anormales) Allele Normal -globin 175 bp Dde. I fragment Large 201 bp Dde. I Large fragment allele mutant morbide -globin 376 bp Dde. I 201 bp 175 bp fragment Large 376 bp Dde. I (a) sites de restriction de l’enzyme Dde. I dans les (b) Electrophorese de fragments de alleles normaux et morbides de gene de -globin restriction des alleles normaux et morbides
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases -Deoxyribonucleases (DNase) -DNase I coupe soit de l'ADN simple brin ou double brin dans des sites essentiellement aléatoires. -Nucléase S 1 & Mung Bean nuclease est spécifique de l'ARN ou de l'ADN simple brin.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les exonucleases -Mung Bean nucléase - Elle digère le simple brin. Toutefois s'il y a « nick (gap) » sur un fragment double brin, elle aura du mal à digérer la liaison phosphodiester se trouvant en face du « nick » sur l’autre brin. - On va l'employer par exemple pour rendre franches des extrémités cohésives.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases -Les ribonucleases (RNase) -La ribonucléase A est l’enzyme de la digestion des ARN. Elle agit comme une endonucléase, préférentiellement après les nucléotides à pyrimidine, en hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5’ du nucléotide suivant.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les endonucleases -Les ribonucleases (RNase) -La ribonucléase H est une enzyme qui hydrolyse le brin d'ARN dans un double brin hybride ADN: ARN. La RNAse H n'hydrolyse pas l'ARN simple brin ou double brin.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les exonucleases - Un deuxième groupe de nucléases qui dégradent l'ADN à partir de l’extrémité de la molécule, sont connus comme des exonucléases. - Exp: - Exonucléase Bal 31 - Exonucléase III - Exonucléase de phage λ
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les exonucleases - Exonucléase Bal 31: activité exonucléase capable de dégrader simultanément 3‘ et 5' terminales de l'ADN double brin - Exonucléase III est une 3' exonucléase qui génère des molécules avec des terminaisons 5’ sortantes.
Enzymes qui coupent les acides nucléiques: Les exonucleases -Exonucléase de phage λ - Hydrolyse de préférence les extrémités 5’phosphate des DNA double-brin
Outils enzymatiques de génie génétique • Des enzymes qui coupent les acides nucléiques • Des enzymes qui collent des bouts d'ADN ensemble • Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • Des enzymes qui recopient les acides nucléiques • Des enzymes qui modifient l’ADN
Enzymes qui ligaturent les acides nucléiques Action de l’ADN ligase 5’ _ O Base O O P O CH 2 Digestion Base O OH DNA ligase O _ _ O O O P O CH 2 3’ Base O O Base Les ADN ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphoester entre le carbone 3’-OH et le phosphate-5’ de deux nucléotides voisins sur un brin de DNA
T 4 DNA Ligase
Enzymes qui ligaturent les acides nucléiques • T 4 ADN Ligase – Ligature rapide et efficace de l'ADN et de l'ARN. – Elle joint également des fragments d'ADN soit avec des extrémités cohésives ou franches, mais n'a pas d'activité sur les acides nucléiques simple brin. T 4 ADN ligase du phage T 4 requiert de l'ATP comme cofacteur
Outils enzymatiques de génie génétique • Des enzymes qui coupent les acides nucléiques • Des enzymes qui collent des bouts d'ADN ensemble • Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • Des enzymes qui recopient les acides nucléiques • Des enzymes qui modifient l’ADN
Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • La phosphatase alcaline : elle retire le phosphate en 5' sur l'ADN, l'ARN et les nucléotides libres. L'élimination des phosphates en 5' empêche toute action des ligases. Un vecteur ouvert ainsi traité ne pourra pas le refermer sur lui même et cette fermeture redeviendra possible par intégration d'un ADN étranger
Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • La T 4 polynucléotide kinase : elle transfère le phosphate d'un ATP sur le phosphate en 5' d'un polynucléotide. Ce marquage en 5' s'effectue en vue de déterminer la séquence d'un ADN.
Outils enzymatiques de génie génétique • Des enzymes qui coupent les acides nucléiques • Des enzymes qui collent des bouts d'ADN ensemble • Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • Des enzymes qui recopient les acides nucléiques • Des enzymes qui modifient l’ADN
Des enzymes qui recopient les acides nucléiques - Les polymérases synthétisent des copies de molécules d'acide nucléique et sont utilisés dans de nombreuses procédures de génie génétique - Lors de la description d'une polymérase, les termes "ADN-dépendante» ou «ARN-dépendante» peuvent être utilisés pour indiquer le type d'acide nucléique modèle (ou la matrice) que l'enzyme utilise - Ainsi, - une ADN polymérase ‘ADN-dépendante’, copie de l'ADN en l'ADN, - une ADN polymerase ‘ARN dépendante’, copie de l'ARN en ADN, - une ARN polymérase 'ADN dépendante’ transcrit l'ADN en ARN.
Des enzymes qui recopient les acides nucléiques - Ces enzymes sont dépendantes d’une matrice et peuvent être utilisées pour copier de longs fragments d'ADN ou d'ARN. -Ces enzymes synthétisent des acides nucléiques en joignant ensemble des nucléotides dont les bases sont complémentaires aux bases du brin matrice. - Le produit de synthèse dans le sens 5 '→ 3', et que chaque addition de nucléotide nécessite un groupe 3'-OH libre pour la formation de la liaison phosphodiester. - Ces enzymes disposent d’activité polymérase (5 '→ 3’), et exonucléase (que ce soit 5'→ 3’ et/ou 3' → 5’). - L’activité 3' → 5’ exonucléase est souvent appelée activité de correction (proofreading).
Des enzymes qui recopient les acides nucléiques - Les ADN polymérase ‘ADNdépendante’
ADN polymerases - ADN polymérase I - Une ADN polymérase qui catalyse de la synthèse d'ADN dans le sens 5'→ 3'. - L'enzyme présente également une activité 3 '→ 5' exonucléase (proofreading) et 5 '→ 3' exonucléase. - Incorpore des nucléotides modifiés (par exemple la biotine, digoxigénine, aminoallyl- nucléotides, marqués par fluorescence
ADN polymerases
ADN polymerases - Fragment de Klenow est le grand fragment de l'ADN polymérase I. - Il présente 5 '→ 3' activité de polymerase et 3 '→ 5' exonucléase (relecture) activité, mais il lui manque 5 '→ 3' exonucléase de l'ADN polymerase I. ADN polymérase I
ADN polymerases - Fragment de Klenow - Le fragment de Klenow est le plus gros des 2 fragments protéiques formés par l'hydrolyse de l'ADN polymérase I d‘ Escherichia coli par une protéase (subtilisine).
Fragment de Klenow - On l’utilise par exemple pour rendre franches des extrémités sortantes, qu’elles soient 3’ sortantes en utilisant l’activité exonucléase ou 5’ sortantes en utilisant l’activité T 4 DNA polymérase
ADN polymerases - T 4 et T 7 ADN polymérases : - Elles ont les mêmes activités que la Klenow (5’-3’ polymérase et 3’-5’ exonucléase). - L’activité exonucléase de la T 4 ADN polymérase est plus importante que l’activité exonucléase de la Klenow, elle sera donc préférée à la Klenow lorsque cette activité est requise.
ADN polymerases -T 7 ADN polymérase modifiée (Séquenase) : -Elles sont dépourvues par une modification du gène de toute activité d’édition (5’→ 3’ exonucléase et 3’→ 5’ exonucléase). -Les séquenases sont les plus rapides de toutes les ADN polymérases. -Les séquenases sont utilisées dans les techniques de séquençage avec des didésoxyribonucléotides (Sanger). -Elles sont responsables de quelques erreurs de l’ordre de 1 mésappariement pour 1000 paires de bases.
ADN polymerases - La Taq ADN polymérase : - Elle a les activités 5'-3' polymérase et 5'->3' exonucléase. - Son avantage est d'être thermostable (résiste à des température très élevées). - Comme elle est dépourvue d'activité 3'-5' exonucléase, le taux d'erreurs est d'environ 10 exp 5 par base dupliquée - Elle très utilisée en PCR et RT-PCR.
Enzyme Activité Pol I 5′→ 3′ polymerase 3′→ 5′ exonuclease (proofreading) 5′→ 3′ exonuclease Pol II 5′→ 3′ polymerase 3′→ 5′ exonuclease Pol III 5′→ 3′ polymerase 3′→ 5′ exonuclease Klenow 5′→ 3′ polymerase (large fragment 3′→ 5′ exonuclease de Pol I) T 4 DNA Pol 5′→ 3′ polymerase 3′→ 5′ exonuclease T 7 DNA Pol 5′→ 3′ polymerase 3′→ 5′ exonuclease Taq polymerase 5′→ 3′ exonuclease Thermostable 5′→ 3′ polymerase DNA polymerase 5′→ 3′ exonuclease 3′→ 5′ exonuclease (proofreading)
ADN polymerases - Terminale transferase – Cette polymérase n'a pas besoin de matrice comme les autres polymérases, elle ajoute des nucléotides en 3' à l'extrémité du brin d'ADN. – C’est une enzyme rare (on n'en parle pas dans les mécanismes généraux de la cellule), elle ajoute des nucléotides en 3' en présence de d. NTP. – Si on veut en ajouter qu'un seul, on ajoute un dd. NTP.
Des enzymes qui recopient les acides nucléiques - Les ADN polymérase ‘ARNdépendante’
ADN polymerases ‘ARN-dépendante’ - Reverse transcriptase (Retro transcriptase ): -Cette enzyme a la même activité que l’ADN polymérase ADN dépendante, mais elle fabrique un ADN à partir d’un ARN. Elle a donc une activité 5’ 3’ ADN polymérase sur un substrat composé d'une amorce hybridée sur un ARN -L’utilisation principale de cette enzyme est la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir des ARN messagers -On peut utiliser trois sortes d’amorce : - soit un oligo d. T dans ce cas on obtient une population d’ADNc. - soit une amorce au hasard, on obtient alors une population d’ADNc dont l’extrémité 5’ est variable - soit une amorce spécifique à une séquence présente sur un ARN, on obtient alors des ADNc de séquence unique correspondant à un seul gène à partir d’ARN
ADN polymerases ‘ARNdépendante’ ADN ARNm dans le cytoplasme - Reverse transcriptase (Retro transcriptase): Extraction de l’ARNm m. RNA Reverse transcriptase Queue Poly-A de l’ARNm Brin Amorce (Oligod. T) ADN ARNm Degradé ADNc ADN polymerase ADNdb
Des enzymes qui recopient les acides nucléiques - Les ARN polymérase 'ADN dépendante’
ARN polymérase 'ADN dépendante’ -ARN polymérase : -L’ARN polymérase reconnaît un promoteur et synthétise un ARN complémentaire au brin en aval de ce promoteur. -La synthèse s'effectue dans le sens 5'-3' en présence de ribonucléotides triphosphates. -Le gène qui nous intéresse doit donc être cloné derrière un promoteur spécifique pour l’ARN polymérase que l'on veut utiliser. -On utilise trois principales ARN polymérases, la T 7 ARN polymérase, la T 3 ARN polymérase et la SP 6 ARN polymérase. -Ces trois polymérases sont issues des phages T 7, T 3 ou SP 6 et reconnaissent chacune un promoteur spécifique, ainsi la T 7 ARN polymérase reconnaît le promoteur T 7 mais pas les promoteur T 3 ou SP 6.
Outils enzymatiques de génie génétique • Des enzymes qui coupent les acides nucléiques • Des enzymes qui collent des bouts d'ADN ensemble • Des enzymes qui travaillent sur les phosphates • Des enzymes qui recopient les acides nucléiques • Des enzymes qui modifient l’ADN
Enzymes qui modifient l’ADN – Les méthylases • Afin de protéger l’ADN bactérien de l’hydrolyse par l’enzyme, une méthylase, codée par le gène de méthylation, va modifier les nucléotides de l’ADN bactérien en les méthylant pour qu’ils ne soient plus reconnus par l’enzyme de restriction.
Outils enzymatiques de génie génétique • Autres enzymes: – Les topoisomérases: • Enlève le super enroulement de l’ADN lors de la réplication. • Une enzyme de restriction et la ligase à la fois. • Elle forme un 3’ phosphate-enzyme et un 5’ OH. Elle peut reformer ensuite la liaison phosphodiester. • En présence d’un fragment d’ADN, elle peut reformer la liaison à condition que la séquence d’ADN soit 5’OH.
Outils enzymatiques de génie génétique • Autres enzymes: – Les topoisomérases
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