Gentica Molecular em Anlises Clinicas TCNICAS DE AMPLIFICAO

Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof. Doutor José Cabeda Genética

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR u Real Time PCR u NASBA/TMA u

PCR

OPTIMIZAÇÃO DO PCR [Mg. Cl 2] n Th n [d. NTP] n [primers] n [DNA] n [inibidores] n

Variações RT-PCR n Multiplex PCR n Nested PCR n

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR u Real Time PCR u NASBA/TMA u

Principio de funcionamento do Real-Time PCR 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

Detecção dos produtos de PCR

Montar uma reacção

Químicas Utilizáveis 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

SYBR-Green I 3’ 5’ Excitation SG SG SG 3’ 5’ SG SG

SYBR-Green I Excitation Emission 5’ 3’ SG SG SG 3’ 5’

Detcção com Syb. Green

Sybr-Green Detection n n Intercalates to ds. DNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and nonspecific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity

Detecção com sondas

Quimicas utilizáveis: sondas taqman

Sequence specific probes: Dual labeled probes 5’ 3’ 3’ 5’ RR R 3’ Excitation Q Q 5’

Quimicas utilizáveis: molecular beacons

Molecular Beacons I FAM Dab. Cyl 10 mer 25 mer

Molecular Beacons II Q Q R R Q R Excitation Emission

Molecular Beacons II Q Q R R Q R Excitation Emission

Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection n Need beacons for the normal and mutation sequence n Design is difficult due to nature of folding structure n Expensive when compared to FRET n

Quimicas utilizáveis: sondas FRET

TM Hyb-Probes Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer Excitation 2001/2002 Emission Prof. Doutor José Cabeda Genética

Quenched FRET analysis 5’ 3’ n n Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH 1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH 1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation

Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse F Q MGB F Q

Aplicações Quantificação 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

End Point versus Real-Time

Quantificação

Aplicações Detecção de Mutações / SNP 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

Detecção de mutações

Aplicações Multiplex Detection 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

Detecção simultânea de vários produtos

Os equipamentos 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Genética

Light Cycler

Smartcycler

Rotorgene n n n The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels • • Ch 1: ex 470 nm, det 510 nm Ch 2: ex 530 nm, det 550 nm Ch 3: ex 585 nm, det 610 nm Ch 4: ex 625 nm, det 660 nm

O Futuro próximo

Detecção com sondas

Detcção com Syb. Green

Quantificação

Detecção de mutações

Detecção simultânea de dois produtos

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR u Real Time PCR u NASBA/TMA u

NASBA/ NUCLISENS

Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: Reverse Transcriptase • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T 7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

Técnicas de amplificação de Sinal n b. DNA (Quantiplex)

b. DNA (I)

b. DNA (II)

b. DNA (III)

b. DNA (IV)

b. DNA (V)