Genotoxicitsi tesztek Bakterilis reverz mutci teszt In vitro

Genotoxicitási tesztek Bakteriális reverz mutáció teszt In vitro mikronukleusz teszt

A genotoxicitás szintjei Kromoszóma típusú mutációk (szerkezeti, számbeli változás) Pontmutációk egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése silent, missense, nonsense frame-shift, leolvasási keret eltolódása A genotípus megváltozása nem mindig vezet a funkció (fenotípus) megváltozásához (silent=csendes mutációk, mutáció nem kódoló régióban) A mutáció lehet: káros, semleges, előnyös

Mutagén – Karcinogén - a mutagén fizikai vagy kémiai ágens, mely növeli a mutációk képződésének gyakoriságát - indukált mutáció a mutagének által okozott változások a genetikai állományban - a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat - a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák - a mutagén vegyületek nagy része rákkeltő (karcinogén) is !!!!!! - évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb. ) - a mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását

Spontán mutációk okai : - a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció) - a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése - a DNS szerkezeti változásai (depurináció és deamináció, amelyek a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)

Tautomerizáció Normál bázispárosodás (keto és amino formák) A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

Indukált mutációk külső okokból származó mutációk vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat: - bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak - alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják - interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak

Bázis analógok a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti pl. 5 -brómuracil (5 BU) timin analóg adeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>5 BU-G>C-G C-G>5 BU-A>T-A 2 -aminopurin (2 AP) adenin analóg a timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>T-2 AP>C-G C-G>C-2 AP>T-A

Alkiláló szerek alkil (-CH 3, -CH 2 -CH 3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl. etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6 -etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4 -etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Deamináló szerek a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni pl. salétromossav a citozint, az adenint és a guanint támadja citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez guanin xantin, ez elsősorban citozinnal, de kisebb mértékben timinnel is párosodva C-G > T-A tranziciót hoz létre hidroxilamin a citozin amino csoportját támadja, és hidroxilaminocitozin keletkezését okozza a hidroxilaminocitozin adeninnel párosodik, és C-G > T-A tranziciót okoz

Interkaláló vegyületek - általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni - a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülést okozza pl. proflavin akridin sárga etidium-bromid dioxin

A genotoxicitás mérése többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer: • bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli) • eukarióta egysejtűek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) élesztőgomba • rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) • gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) • növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) • in vivo (egér, hörcsög, patkány) penészgomba

Alternatív (= in vitro) genotoxicitási tesztek - állatkísérletek számának csökkentése - gyors (short term study) - költséghatékony Végpontok: • pontmutáció • DNS törés • repair (DNS szintézis NEM az S fázisban) • kromoszóma aberrációk

Mutációk detektálása - a fajok nemzedékről nemzedékre mutatott állandósága arra utal, hogy a mutációk bekövetkezése ritka esemény - a valóságban azonban a megfigyelhetőnél jóval több mutáció keletkezik körülbelül 1, 000, 000 (1018) DNS sérülés minden felnőtt emberben naponta! kb. 30. 000 (3 x 1010) sejtünk van. . . (~3 x 107/nap/sejt) - mivel leggyakoribbak a recesszív mutációk, a legtöbb új mutáció észlelését a dominancia megakadályozza - az új mutációk észlelése ezért a legegyszerűbb a haploid szervezetekben - diploidokban a mutációk kimutatására speciális rendszerek szükségesek - a mutációk gyakorisága alacsony, ezért mutánsokat nagy egyedszámú populációból lehet kimutatni

Bakteriális reverz mutagenitási teszt Kidolgozója, Bruce Ames után AMES teszt Validált (OECD Guideline 471) Pontmutációk észlelésére alkalmas Több humán genetikai betegség pontmutációkra vezethető vissza. Baktérium törzsek: auxotróf mutánsok • Salmonella typhimurium: his- : hisztidint és biotint igényel • Escherichia coli: trp- : triptofánt igényel - nem képesek minimál táptalajon növekedni -megnövelt mutációs érzékenység: megnövekedett sejtfal áteresztő képesség DNS hibajavító rendszer kiküszöbölése -metabolikus aktiválás kell: S 9 frakció : patkány májából készült enzimkivonat a baktériumok nem rendelkeznek oxidatív metabolizáló enzimrendszerrel Nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálására alkalmas

A baktériumok által képzett telepek Salmonella E. coli

Salmonella typhimurium his- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására his- Reverzió = back mutáció Hisztidin bioszintézisére képtelen Csak hisztidint tartalmazó tápközegben életképes his+ Hisztidint szintetizál Hisztidinmentes tápközegben életképes Escherichia coli trp- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására Reverzió = back mutáció trp. Triptofán bioszintézisére képtelen Csak triptofánt tartalmazó tápközegben életképes trp+ Triptofánt szintetizál Triptofánmentes tápközegben életképes

A teszttörzsek jellegzetességei Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet: • bázispár szubsztitúcióval • frame-shift segítségével különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt a genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról

A kísérlet kivitelezése

A kísérlet kivitelezése S 9 – patkány májából készült enzimkivonat S 9 -et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására

Pozitív kontroll ellenőrzése

Az eredmények értékelése A kísérleti anyag mutagénnek tekinthető, ha: -A kísérleti anyaggal kezelt lemezek revertánsszámai a kontroll lemezek revertánsszámaihoz képest koncentrációfüggő növekedést mutatnak -A revertánsszámok reprodukálható, biológiailag jelentős növekedést mutatnak legalább egy koncentrációcsoportban, legalább egy baktériumtörzsnél metabolius aktiváló rendszer hozzáadásával vagy anélkül Törzsek: TA 1535, TA 100, TA 98, TA 1537 és TA 102 vagy E. coli WP 2 uvr. A Biológiailag jelentős: törzsenként változik (2 -szeres, 3 -szoros) Statisztikai értékelés nem szükséges

Továbbfejlesztett Ames teszt (Ames II) 96 lukú mikrotitráló lemezen 6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre p. H indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget Lila: nem mutáns Sárga: back-mutáns

In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, érzékenyebb, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus ágensre adott sejtválasz:

In vitro mikronukleusz teszt - acentrikus kromoszóma fragment – klasztogén anyag - centromérral rendelkező fragment – aneugén anyag (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz A klasztogén anyagok törést okoznak a DNS-ben, így az osztódás során kromoszóma fragmentek veszhetnek el, vagyis mikronukleusz képződhet belőlük. Az aneugén anyagok olyan változást okoznak a sejtosztódásnál, ami aneuploidiához vezet. Az aneuploidia a normális diploid kromoszómaszámtól való eltérés, vagyis például egy teljes kromoszóma elvesztése, avagy mikronukleusszá való alakulása.

A mikronukleusz képződés módjai

A mikronukleusz képződés módjai A genetikai anyag a sejtmembrán felé áramlik. Ezek szerint a mutagén anyaggal való expoziót követően először a sejtmag alakja változik meg, bimbózni kezd, majd a sejtmagból kizárt DNS darabkák mikronukleusz formát öltenek, és ezt követően még a sejtből is kizáródhatnak mini sejt formájában. A: exponált sejt B: metafázis C: poliploid metafázis D: poliploid sejtmag E: szabálytalan sejtmag F: bimbózó sejtmag G: szabálytalan sejtmag és mikronukleusz H: szabálytalan sejtmag és mini sejt

In vitro mikronukleusz teszt A kísérlet kivitelezése sejtek felszaporítása kísérleti anyag koncentráció sorával való kezelés, kontrollok rátenyésztés citokelazin. B hozzáadásával a tenyésztés terminálása kicseppentés, festés, fedés A kísérlet értékelése mikronukleált binukleáris sejtek összes sejthez való viszonyítása morfológiai kritériumok: MN<sejtmag/3 jól szeparált, nem bimbózó azonos festődési intenzitás a sejtmaggal