Genotoxic stress UV apoptosis marker PARP cleavage Hyunkoo

Genotoxic stress에 의한 세포 내 반응 Ⅱ UV 조사에 의한 apoptosis의 marker로 PARP cleavage 확인 Hyunkoo Kang Biochemistry Lab

Apoptosis Assay세포사멸 확인 실험 Viability assay (Trypan blue, MTT …) DNA fragmentation assay Comet assay (Single Cell Gel Electrophoresis assay)

Apoptosis Assay세포사멸 확인 실험 G 0/G 1 S G 2/M S Annexin V / PI staining Cell cycle (DNA content) assay

Apoptosis Assay세포사멸 확인 실험 Mitochondrial membrane potential assay Western blot (Apoptosis marker protein)

가설 설정 • UV 조사에 따라 활성화된 caspase-3가 target protein을 cleavage → apoptosis 유도 • 활성화된 caspase-3에 의해 target protein인 PARP가 cleavage 되어 apoptosis를 유도할 것이다.

이번 주 실험 계획 • UVB / UVC 조사 6시간 후 caspase-3/7 의 target protein 인 PARP의 cleavage를 western blot으로 확인한다. blot • Control, UVB 100 J/m 2, 500 J/m 2, UVC 100 J/m 2, 500 J/m 2

Western blot 실험 순서 ① Cell culture ② UVB / UVC 조사 ③ Cell lysates sampling (protein samples) ④ SDS-PAGE ⑤ Transfer ⑥ Blocking ⑦ 1 st antibody treatment ⑧ 2 nd antibody treatment ⑨ Band detection

Western Blotting

실험 준비물 • TBST (Tris-buffered saline with Tween-20) • Blocking solution – 1% BSA (Bovine serum albumin) in TBST – 1% Skim milk in TBST • 1 st antibody (PARP, α-tubulin) • 2 nd antibody (Rabbit Ig. G (HRP), Mouse Ig. G(HRP)) – HRP (Horseradish peroxidase) conjugated • ECL kit (Enhanced chemiluminescence detection kit) • Developer and Fixer

실험 방법 1) 세포에 자외선 조사 후 6시간 incubation한다. ; Control, UVB 200 J/m 2, UVB 700 J/m 2, UVC 200 J/m 2, UVC 700 J/m 2 2) Lysis buffer를 이용하여 cell lysate를 만든다. 3) Bradford assay로 단백질을 정량 한 후 같은 농도로 sample을 만든다. 4) 각 sample을 동일한 양을 loading하여 SDS-PAGE를 수행한다. 5) 전기영동한 gel을 nitrocellulose membrane으로 trasnfer한다. 6) Membrane에서 필요한 부분만 자른 후 blocking solution을 1 hr 처리한다. (blocking solution : 5% BSA or skim milk in TBST)

실험 방법 7) 1 st antibody (in blocking solution)를 넣고 4 ℃ overnight 또는 2~3시간 room temperature에서 incubation한다. – PARP (1: 4000) / α-tubulin (1: 5000) 1조 : 1% BSA in TBST 2조 : 1% BSA in TBST 3조 : 1% skim milk in TBST 4조 : 1% skim milk in TBST 8) TBST로 washing 3 min, 3회 반복한다. (1 well 당 TBST 2 ml, 이 때 membrane 조심!) 9) 2 nd antibody를 넣고 1시간 incubation한다. – Anti-rabbit Ig. G (1: 10000) : 1% BSA or skim milk (blocking solution과 동일 물질이용) – Anti-mouse Ig. G (1: 10000) : 1% BSA or skim milk (blocking solution과 동일 물질이용) 10) TBST로 washing 3 min, 3회 반복한다. (1 well 당 TBST 2 ml, 이 때 membrane 조심!) 11) ECL (Enhanced chemiluminescence) detection system로 반응시킨다.

1조 2조 3조 4조 Blocking Solution 5% BSA in TBST 5% skim milk in TBST 1 st antibody Solution 1% BSA in TBST 1% skim milk in TBST 2 nd antibody Solution 1% BSA in TBST 1% skim milk in TBST membrane PARP (1 st antibody) / rabbit Ig. G (2 nd antibody) membrane α-tubulin (1 st antibody) / mouse Ig. G (2 nd antibody)

Caspase Target Proteins

Caspase target protein : PARP § Cleaved Caspase: Activated Caspase § Cleaved PARP: DNA repair-inactivated PARP

PARP : poly(ADP-ribose) polymerase DBD : DNA-binding domain AD : automodification NAD+ : Nicotinamide adenine dinucleotide p. ADPr : poly(ADP) ribose PARG : Poly(ADP-ribose) glycohydrolase ARH 3 : ADP-ribose hydrolase 3 AMPK : AMP-activated protein kinase PRPP : Phosphoribosylpyrophosphate ATM : Ataxia telangiectasia-mutated BER : Base excision repair BRCT : BRCA 1 carboxy-terminal repeat motif DNA-PKcs, DNA-protein kinase catalytic subunit DSB : Double-strand break HR : Homologous recombination NHEJ : Non-homologous end joining NLS : Nuclear localization signal PPi : inorganic pyrophosphate SSB : Single-strand break Zn : Zinc finger Nat. Rev. Cancer 2010 10: 293 -301

v PARP cleavage 부위 * DEVD: Asp-Glu-Val-Asp 24 k. D 89 k. D v Caspase-3/7을 통한 substrate cleavage 부위

예비 실험 1 116 k. Da 89 k. Da 2 3 4 1 : Control 5 PARP α-Tubulin 2 : UVB 100 J, 6 hr incubation 3 : UVB 500 J, 6 hr incubation 4 : UVC 100 J, 6 hr incubation 5 : UVC 500 J, 6 hr incubation