Genetyczne czynniki chorobotwrcze Etiologia i patogeneza wybranych zaburze

Genetyczne czynniki chorobotwórcze Etiologia i patogeneza wybranych zaburzeń genetycznych u zwierząt

Genetyczne czynniki chorobotwórcze 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Kariotypy zwierząt domowych. Metody badania i zasady opisu kariotypów. Kariotypy wzorcowe i identyfikacja chromosomów przy użyciu prążków G i C. Typy mutacji punktowych i chromosomalnych: strukturalnych i liczbowych. Zaburzenia genetyczne u zwierząt domowych spowodowane przez mutacje chromosomalne strukturalne: translokacja robertsonowska u bydła, odwrócenie płci u koni, odwrócenie płci u psów. Mutacje chromosomalne strukturalne jako przyczyny nowotworów – chromosom Philadelphia (Ph 1) u ludzi i psów. Zaburzenia genetyczne u zwierząt domowych spowodowane przez mutacje chromosomalne liczbowe (monosomia chromosomu X u klaczy, trisomie chromosomów somatycznych u koni i bydła, występowanie nadliczbowych chromosomów X lub Y u koni). Metody identyfikacji mutacji genowych: PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy RFLP – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Choroby genetyczne uwarunkowane mutacjami genowymi – etiologia i patogeneza (BLAD – niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych u bydła, DUMPS – niedobór syntazy monofosforanu urydyny u bydła, PSS – syndrom stresowy u świń) Wykorzystanie metod PCR i RFLP w diagnostyce BLAD, DUMPS i PSS. Reakcja PCR i RFLP – animacje komputerowe. 14. Ćwiczenie praktyczne: izolacja chromosomów i analiza kariotypu w oocytach prawidłowych oraz oocytach z zaburzeniami o charakterze euploidii i aneuploidii pochodzących od świń.

Diploidalna liczba chromosomów niektórych gatunków zwierząt (wg Datta’y 1979, Kluga i cummingsa 1983, Larousse’a 1990 oraz Świtońskiego 1982, 1987, 1988) Nazwa zwyczajowa Człowiek Szympans Goryl Rezus Bydło domowe Bydło zebu Bawół azjatycki Koza Owca Świnia domowa Dzik Koń domowy Koń Przewalskiego Osioł Onager (półosioł) Wielbłąd jednogarbny Pies Szakal Lis pospolity Nazwa gatunkowa Homo sapiens Pan troglodytes Gorilla gorilla Macaca mullata Bos taurus Bos indicus Bubalus bubalis Capra hirus Ovis aries Sus domestica Sus scrofa Equus caballus przewalski Equus asinus Equus hemionus onager Camelus dromedarius Canis familiaris Canis aureus Vulpes vulpes 2 n 46 48 48 42 60 60 48 60 54 38 36 64 66 62 56 70 78 78 34 W niektórych narządach, np. wątrobie, występują komórki o zwielokrotnionej liczbie chromosomów, zwane poliploidalnymi

W zależności od umiejscowienia centromeru chromosomy dzielimy na: 1. Metacentryczne – centromer pośrodku długości chromosomu 2. Akrocentryczne – centromer blisko końca chromosomu 3. Submetacentryczne – pozycja pośrednia centromeru w odniesieniu do chromosomów meta- i akrocentrycznych 4. Telocentryczne – centromer na końcu chromosomu W chromosomie metacentrycznym ramiona p (krótkie) i q (długie) są równej długości

Typy mutacji chromosomowych strukturalnych 1. Deficjencja a) terminalna b) interstycjalna 2. Translokacje a) fuzje centryczne b) insercje 3. Duplikacja 4. Inwersja a) paracentryczna b) pericentryczna 5. Izochromosomy 6. Chromosomy pierścieniowe 7. Chromosomy dicentryczne

Trisomie chromosomów bydła Kariotyp Rasa Płeć Fenotyp 60, XX + 22 Simental F Normalny 60, XX t(12; 12)+12 Simental F Defekt budowy, martwe urodzenia 60, XX t(20; 20)+20 Simental F Defekt budowy, martwe urodzenia 61, XX + 19 Simental F Normalny 61, XY + 20 Romanga la M Deformacja kończyn, ślepota , brak zewnętrznych narządów płciowych 61, XY + 27 Hereford M Ogólny niedorozwój narządów wewnętrznych, hipoplazja płuc 60, XX/60, XY/61, XXY Simental M Hipoplazja jąder, degeneracja nasieniowodów 61, XXY Simental M Hipoplazja jąder, oligospermia 60, XY/61, XXY Hereford M Niska jakość nasienia 61, XXY Hereford M Żeńskie cechy budowy, hipoplazja jąder, azoospermia 61, XXX Charolaise F Normalny

Translokacja robertsonowska – fuzja centryczna pojawiająca się najczęściej u bydła. Polega na połączeniu się centromerami dwóch akrocentrycznych autosomów i wytworzeniu formy meta- lub submetacentrycznej. Wystąpienie takich struktur w komórkach prowadzi do zmniejszenia ogólnej liczby chromosomów z utrzymywaniem się dotychczasowej liczby ramion chromatyd i nie zmienionej ilości DNA. Najczęściej spotykana jest fuzja największego (1) i najmniejszego (29) autosomu, znana jako translokacja 1: 29. Ta forma aberracji występuje u ponad 60 ras bydła domowego, m. in. u szwedzkiego czerwono-białego, rasy południowosyberyjskiej i u rasy polskiej czerwonej. Nosiciele translokacji – zarówno buhaje, jak i krowy odznaczają się prawidłową budową i parametrami fizjologicznymi. Negatywnym efektem tej aberracji jest obniżenie płodności nosicieli powodowane wzrostem wczesnej śmiertelności zarodkowej. Translokacje robertsonowskie stwierdza się także u owiec, kóz, świń i lisów polarnych (u tych ostatnich obserwuje się korzystne efekty mutacji).

Translokacja albo fuzja robertsonowska chromosomu 1/29 u krowy

PCR – Polymerase Chain Reaction (łańcuchowa reakcja syntezy fragmentów DNA RFLP- Restriction Fragment Lenght Polymorphism (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) BLAD- Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (wrodzony niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych u bydła) LAD- Leukocyte Adhesion Deficiency (wrodzony niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych) DUMPS-Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (wrodzony deficyt syntazy monofosforanu urydyny) PSS- Porcine Stress Syndrome (zespół stresowy świń)

Zastosowanie techniki PCR 1) Identyfikacja kwasów nukleinowych genów, bakterii, wirusów 2) Wykrywanie czynników zakaźnych, zwłaszcza latentnych wirusów 3) Prenatalna diagnostyka genetyczna 4) Wykrywanie polimorfizmu alleli 5) Precyzyjne ustalanie typu tkanek do transplantacji 6) Badania nad ewolucją przy wykorzystaniu próbek kopalnych 7) Diagnostyka chorób genetycznych – etap wstępny

Materiałem do izolacji kwasu nukleinowego mogą być: hodowla komórkowa, bakterie, krew, wyciągi tkankowe, mleko, sperma, cebulki włosowe Aby zamplifikować poszukiwany fragment DNA potrzebne są: 1) Wyizolowany z materiału biologicznego i oczyszczony DNA (matryca) 2) Mieszanka nukleotydów zawierająca A, C, G, T –składniki potrzebne do zbudowania nowej nici interesującego nas fragmentu DNA 3) Polimeraza DNA 4) Czynniki inicjujące syntezę – startery - syntetyczne oligonukleotydy o sekwencji odpowiadającej ściśle obu końcom powielanego odcinka

Postępowanie przy wykrywaniu chorób genetycznych 1) Izolacja DNA z wybranego materiału biologicznego 2) Amplifikacja metodą PCR analizowanego fragmentu DNA 3) Analiza restrykcyjna zamplifikowanego genu (RFLP) 4) Uwidocznienie fragmentów restrykcyjnych za pomocą elektroforezy (charakterystyczny dla danego genu i mutacji zestaw fragmentów restrykcyjnych o określonej długości pozwalający stwierdzić, czy badany materiał pochodził od osobnika zdrowego, chorego, czy też od nosiciela)

Niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych u bydłą (BLAD)

383 nukleotyd GEN PRAWIDŁOWY…. CATCGACCTGT… MUTACJA BLAD …. . CATCGGCCTGT …. Taq I 1 2 3 1 genotyp normalny 2 homozygota mutacji BLAD 3 nosiciel mutacji BLAD Wykrywanie mutacji punktowej będącej przyczyną BLAD u cieląt metodami PCR/RFLP.

Wykrywanie mutacji punktowej będącej przyczyną DUMPS u bydła metodami PCR/RFLP.

Przykłady enzymów restrykcyjnych wykorzystywanych w technice RFLP oraz rozpoznawanych przez nie sekwencji palindromowych

Wykrywanie mutacji punktowej będącej przyczyną PSS u świń u osobników chorych i nosicieli metodami PCR/RFLP.

Nondysjunkcja mejotyczna jako przyczyna aberracji liczbowych o charakterze aneuploidii

Kariotyp (chromosomy w płytce metafazowej) pochodzące od: a. klaczy (64, XX) b. ogiera (64, XY) c. klaczy z monosomią chromosomu X (63, X 0) d. klaczy z trisomią chromosomu X (65, XXX)

Ćwiczenie praktyczne: izolacja chromosomów i analiza kariotypu w oocytach prawidłowych oraz oocytach z zaburzeniami o charakterze euploidii i aneuploidii pochodzących od świń. 1. Jajniki pobrać podczas uboju i w ciągu godziny przetransportować do laboratorium w płynie fizjologicznym (temp. 30 -37 o. C). 2. Wyznaczyć na szkiełku podstawowym pole o pow. ok. 1 cm 2. 3. Umieścić kroplę podłoża hodowlanego w wyznaczonym polu. 4. Po oczyszczeniu jajnika z okolicznych tkanek, przepłukaniu w płynie fizjologicznym oraz umieszczeniu w jałowej płytce Petriego, wykonać nakłucie pęcherzyków i aspirację płynu zawierającego oocyty. 5. Pobrany płyn przenieść do kropli podłoża umieszczonej na szkiełku podstawowym i pod kontrolą mikroskopu sprawdzić miejsce położenia oocytów. 6. Oocyty poddać działaniu I-go roztworu utrwalającego (metanol/kwas octowy – 1: 1) – nanosząc pod kontrolą mikroskopu 1 -2 krople – pozostawić na 5 min. 7. Następnie nanieść na preparat oocytów 1 -2 krople II-go roztworu utrwalającego (metanol/kwas octowy – 3: 1) – pozostawić na 60 min. , uzupełniając roztwór w przypadku wysychania. 8. Usunąć nadmiar II-go roztworu utrwalającego i zabarwić preparaty 5% roztworem barwnika Giemzy (5 -10 min). 9. Dokonać pod mikroskopem analizy pod kątem oceny stadium dojrzewania i występowania ewentualnych aberracji.

Chromosomy wyizolowane z oocytów świń obraz spod mikroskopu odwróconego pola Oocyt - klasa III Oocyt - klasa IV

Analiza chromosomów (Giemsa, FISH) w ooocytach świń dojrzewającyhch in vitro. Giemsa: (A)oocyt haploidalny(n = 19); (Boocyt diploidalny (2 n = 38). FISH: ©oocyt haploidalny; (D) aneuploidia disomia chromosomu 1; (E) aneuploidia disomia chromosomu 10; (F)oocyt diploidalny.