Genetica Forense 6 CFU Laurea in Scienze biologiche

Genetica Forense 6 CFU Laurea in Scienze biologiche Sapienza Università di Roma III anno I semestre Docente: Fulvio Cruciani fulvio. cruciani@uniroma 1. it Edificio genetica, stanza 3 -09 (2°piano) Telefono : 06 49912826 / 2924 Per altre informazioni sull’insegnamento: https: //elearning 2. uniroma 1. it/ (iscrivetevi su elearning per ricevere comunicazioni dal docente)

Genetica Forense Programma AA 2019 -2020 n n n n n v v v Breve storia della genetica forense: dal sistema AB 0 ai genomi completi. La variabilità genetica umana e la sua utilizzazione come strumento d'indagine forense. La genetica delle popolazioni nelle inferenze genetico-forensi. Raccolta, conservazione e determinazione del tipo cellulare e/o tissutale dei reperti biologici. Estrazione differenziale, quantificazione e determinazione del sesso genetico del DNA dei reperti. Metodi per la tipizzazione di marcatori polimorfici in ambito forense. Problematiche relative alla natura del campione biologico: DNA fortemente degradato e/o in tracce minime; determinazione dei genotipi in campioni misti. Problematiche concernenti l’interpretazione del profilo di DNA: stuttering, microvarianti e alleli “off-ladder” nei microsatelliti, alleli nulli, drop-out e drop-in allelico. Utilizzazione dei sistemi a ereditarietà uniparentale (cromosoma Y e mt. DNA) in ambito forense. La peculiarità dei polimorfismi del cromosoma X come strumento d'indagine. Elementi di calcolo delle probabilità. Likelihood ratio e statistica Bayesiana. Probabilità d'identità, probabilità di match casuale, potere di esclusione e indici di variabilità genetica. Test di parentela e paternità. Indice di paternità. Inferenza sull’origine geografica, aspetto fenotipico ed età attraverso l’analisi del DNA. Identificazione nelle indagini criminali; identificazione delle vittime dei disastri di massa; indagini sulle persone scomparse; the "innocence project" La ricerca scientifica in ambito genetico-forense. Applicazioni del next generation sequencing nelle investigazioni forensi. La genetica forense animale L'importanza dei database di profili genetici e di frequenze alleliche ed aplotipiche. La genetica forense nel dibattimento processuale In giallo: Lezioni tenute dal Maggiore Giuseppe Iacovacci (Banca Dati Nazionale del DNA) In verde: Lezioni tenute dalla Dr. ssa Luisa Garofalo (Istituto zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana) In bianco: Lezioni tenute dal titolare del corso

Genetica Forense Testi consigliati in italiano Per approfondimenti

Premessa Nozioni di base genetica formale e genetica delle popolazioni

Ricordiamo alcuni termini. . . - Gene (alcune possibili definizioni): fattore che determina un carattere la cui ereditarietà segue le leggi di Mendel (definizione mendeliana) oppure unità funzionale del DNA (definizione funzionale) - Locus (plurale loci) regione di un cromosoma che identifica in modo preciso un gene o una sequenza qualsiasi di DNA - Alleli forme alternative di un gene (più in generale, forme alternative di un qualsiasi locus) - Genotipo è dato dall’insieme degli alleli ad uno o più loci (due alleli per ciascun locus per organismi diploidi) - Fenotipo (o carattere o tratto) caratteristica osservabile (a qualsiasi livello) di un organismo - Omozigosi, eterozigosi, emizigosi

Il genoma umano

La variabilità genetica (V. G. ) 1. V. G. somatica 2. V. G. gametica intra-individuo 3. V. G. gametica intra-popolazione (polimorfismo) 4. V. G. gametica inter-popolazione 5. V. G. gametica inter-specie (filogenetica)

Variabilità genetica INTRA-SPECIE (intra- e inter-popolazione)

Variabilità genetica INTER-SPECIE

Variabilità genetica a livello molecolare

Descrivere la variabilità genetica di una popolazione Nella genetica, una popolazione è perfettamente rappresentata attraverso le frequenze dei suoi genotipi. Da questi, è possibile calcolare le frequenze alleliche e diversi indici «sintetici» di variabilità (ad esempio l’eterozigosità). Si noti tuttavia che popolazioni con identiche frequenze alleliche potrebbero avere differenti genotipi (ma non viceversa).

Un allele è una variazione ad un locus (codificante o meno), ad esempio una sostituzione nucleotidica C-T: Allele C: CCGCTACGGCGATGGCGGCCACGCTCGCGATCGCTACGC Allele T: CCGCTACGGCGATGGCGGCTACGCTCGCGATCGCTACGC La frequenza allelica può essere calcolata a partire dalle frequenze (assolute o relative) dei genotipi nella popolazione. Es. Popolazione composta da 20 omozigoti CC (frequenza relativa = 20/100 = 0, 20) 45 eterozigoti CT (frequenza relativa = 45/100 = 0, 45) 35 omozigoti TT (frequenza relativa = 35/100 = 0, 35) (metodo 1) Frequenze alleliche partendo dalle frequenze genotipiche assolute (anche detto metodo della conta degli alleli) Frequenza allele C = (20 × 2 + 45)/ (2 × 100) = 0. 425 Frequenza allele T = (35 × 2 + 45)/ (2 × 100) = 0. 575 (metodo 2) Frequenze alleliche partendo dalle frequenze genotipiche relative: Frequenza allele C = 0, 2 + ½ × 0, 45 = 0. 425 Frequenza allele T = 0, 35 + ½ × 0, 45 = 0. 575

STIMA DI FREQUENZE ALLELICHE Se stiamo analizzando (come quasi sempre accade) un campione di una popolazione, quella ottenuta è una stima delle frequenze alleliche della popolazione. Questa stima avrà un proprio errore che può essere calcolato come:

Probabilità di un evento è la frequenza relativa con cui l’evento si verifica in una lunga serie di prove ripetute sotto condizioni simili Probabilità che si verifichi un evento “A” = Pr(A) Probabilità che si verifichi un evento “B” = Pr(B) La probabilità che si verifichino l’uno o l’altro di due eventi incompatibili (due eventi si dicono incompatibili se il verificarsi dell’uno esclude il verificarsi dell’altro) Pr(A o B) = Pr(A U B) = Pr(A) + Pr(B) (Principio della somma) Esempio: probabilità che tirando un dado esca un 6 oppure un 5 Esempio sbagliato: probabilità che estraendo una carta esca un cuori oppure un asso La probabilità che si verifichino sia l’uno che l’altro di due eventi indipendenti (due eventi si dicono indipendenti se il verificarsi dell’uno non influenza la probabilità di verificarsi dell’altro) Pr(A e B) = Pr(A ∩ B) = Pr(A) × Pr(B) (Principio del prodotto) Esempio: Probabilità che tirando due volte un dado esca prima un 6 E dopo un 5 Esempio sbagliato: probabilità che un individuo italiano a caso sia biondo E con gli occhi azzurri…

Parte 1 Introduzione alla Genetica forense

La genetica nelle scienze forensi La genetica forense è una delle molteplici discipline delle scienze forensi e può essere definita come lo studio della variabilità genetica finalizzato alla risoluzione di controversie legali in ambito sia civile che penale L’importanza della genetica come strumento d’indagine legale si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie ai progressi sulla conoscenza dei marcatori genetici polimorfici ed all’evoluzione di strumenti sempre più sofisticati per analizzarli

La genetica come «strumento» d’indagine in ambito forense e investigativo n n n Identificare individui che abbiano commesso dei crimini Risolvere casi di paternità incerta Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc. ) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore occhi) Identificare e «ricostruire» cadaveri la cui identità sia ignota (vittime di catastrofi naturali, disastri aerei, guerre, genocidi) Investigazioni su persone scomparse Non-human forensic DNA testing: n DNA profiling in animali domestici comuni n n Tracciare la provenienza di sostanze illegali a fini investigativi Identificare DNA appartenente a specie protette (es. mistificazioni alimentari)

Il fenomeno biologico sul quale si basa la genetica forense: DIVERSITA’ GENETICA

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: A QUALE LIVELLO? Applicazione in Ambito forense 1. Diversità genetica tra individui 2. Diversità genetica tra popolazioni 3. Diversità genetica tra specie ü Nella maggior parte delle applicazioni la genetica forense sfrutta la diversità genetica tra individui (variabilità intra-popolazione). ü In alcuni casi sfrutta «direttamente» la variabilità genetica tra popolazioni (della quale va sempre tenuto conto!). ü In un minor numero di casi sfrutta la variabilità genetica tra specie.

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: A QUALE LIVELLO? Applicazione in ambito forense 1. Diversità genetica tra individui 2. Diversità genetica tra popolazioni 3. Diversità genetica tra specie Le basi teoriche della genetica forense vanno ricercate nella genetica mendeliana e nella genetica delle popolazioni

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: IN QUALE PORZIONE DEL GENOMA? • Autosomi Rilevanza in Ambito forense • Cromosoma Y • DNA mitocondriale • Cromosoma X I marcatori più utilizzati in ambito forense sono localizzati sugli autosomi

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: CHE TIPO DI VARIAZIONE? Rilevanza in ambito forense • • Microsatelliti (short tandem repeats, STRs) Sostituzioni nucleotidiche (~ SNPs) Minisatelliti (~ VNTR) Inserzione/delezione di basi (indels) Presenza assenza di elementi trasponibili Copy number variants (CNVs) Polimorfismi «citogenetici» I marcatori più utilizzati in ambito forense sono i microsatelliti

Sospettato individuato Crimine Trasferimento del materiale biologico May match another Campione “Q” (Question) Reference campione “K” (Known) (K’) Ricerca in database Steps coinvolti Raccolta Caratterizzazione Biology Estrazione Quantificaz. Amplificaz. Technology Marcatori polimorfici Genetics Esclusione (no match) Conservazione Controllo di qualità Serology Raccolta Q≠K Q Confronto dei profili Q=K Compatibilità (match) Separazione/ detection Interpretazione dei dati Interpretazione statistica Profilo depositato in database K Report (con peso statistico) Conservazione Estrazione Quantificaz. Amplificaz. Marcatori polimorfici Separazione/ Detection Interpretaz. ne dei dati Corte Profilo depositato in database

Esempio di Lab Report relativo ad un indagine sul DNA estratto da 2 reperti (Q 1 e Q 2) e da due indagati (K 1 e K 2) Tratto da Butler JM «Fundamentals of forensic DNA typing» 2010.

Parte 2 Storia della genetica forense

Breve storia della genetica forense Il primo sistema polimorfico utilizzato in ambito forense: Sistema di gruppo sanguigno ABO (scoperto nel 1900 da Landsteiner) Utilizzato per la prima volta in un processo nel 1915 in Italia (Lattes) e successivamente utilizzato in casi di identificazione e paternità incerta anche in altri paesi europei ed in US Caratteristiche : 3 alleli (IA = IB > i) domin. /codominanza 4 fenotipi (gruppi sang. A, B, AB, 0) Rapidità di esecuzione Possibilità di esclusione Limitato potere di discriminazione ------------------------------------------- Successivamente affiancato da altri sistemi di gruppo sanguigno: MN (1927), Rh (1937) fino a circa 50 sistemi di gruppo sanguigno oggi noti

Breve storia della genetica forense L’era dei polimorfismi proteici/enzimatici Differenze nel materiale genetico possono «tradursi» in differenze nelle sequenze aminoacidiche delle proteine. Tali differenze vennero utilizzate negli anni 60 -80 per studi di genetica di popolazioni ed in ambito forense. Differenti forme dello stesso enzima (isoenzimi) venivano evidenziate mediante elettroforesi su agar, agarosio o acrilammide, sfruttando la differente carica degli isoenzimi per la separazione. La specificità enzimatica veniva al termine della corsa utilizzata per innescare una reazione che culminava con la produzione di una sostanza visibile Caratteristiche rilevanti in ambito genetico-forense: - Numero di alleli ridotto (in genere 2 -4); - Tempi di esecuzione relativamente lunghi -Potere di discriminazione maggiore (quando combinati) rispetto ai sistemi di gruppo sanguigno -Livelli bassi di proteine nei reperti; Instabilità

Breve storia della genetica forense Minisatelliti I minisatelliti sono una classe di DNA ripetuto in tandem, con un motivo ripetuto di 8 -100 basi ed un numero di ripetizioni spesso molto elevato (fino a 1000). Sono localizzati in tutto il genoma umano, preferenzialmente nelle regioni subtelomeriche. Il polimorfismo consiste nel diverso numero di ripetizioni in tandem (alleli) presenti nello stesso minisatellite. Il numero degli alleli è spesso nell’ordine delle decine (esempio di sistema multiallelico).

Breve storia della genetica forense Minisatelliti: la tecnica del «DNA fingerprinting» Il metodo per evidenziare la variabilità dei minisatelliti si basa sulla tecnica «southern blotting» . Si utilizza una sonda che riconosce un motivo “core” comune a più minisatelliti, e che permette quindi di evidenziare più minisatelliti contemporaneamente. Il DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys nel 1985. Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus “core” minisatellite marcata con radioattivo per l’ibridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X Alec Jeffreys

Breve storia della genetica forense 1985: MINISATELLITI, inizia l’era del DNA typing CASE STUDY (1) Il primo caso criminale risolto mediante DNA typing: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. Si decise di utilizzare la nuova tecnica del DNA fingerprinting mediante la quale si confermò che i due omicidi erano riconducibili allo stesso individuo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, viene incriminato dei due delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivela la sua innocenza. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui risultò corrispondere a quello del reperto. 1987: Per un puro caso, si venne a sapere che una persona del posto, un certo Colin Pitchfork, aveva chiesto ad un amico ed ottenuto di partecipare allo screening in sua vece. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

Breve storia della genetica forense Minisatelliti: vantaggi e limitazioni Vantaggi e limitazioni: Potere di discriminazione molto elevato Sensibilità limitata (>50 -500 ng) Tecnica time-consuming Non automatizzabile Elevato peso molecolare: non adatto per campioni degradati Differenti alleli difficili da distinguere Problemi per l’interpretazione statistica Note sulla nomenclatura: ambiguità relativa ai termini RFLP, VNTR, DNA fingerprinting Introduzione di sonde che riconoscono un solo locus

Breve storia della genetica forense Minisatelliti: esempio di «DNA fingerprinting» DNA fingerprinting di una famiglia. E’ stata utilizzata una sonda multicolus di tipo (GTG)5 Prima e ultima lane: profilo di un individuo non correlato alla famiglia Seconda e terza lane: padre e madre Lanes 4 -22: figli

Breve storia della genetica forense 1985: viene descritta la tecnica PCR 1990: la tecnica PCR viene accolta in ambito forense La tecnica della reazione a catena della polimerasi ha rivoluzionato il modo di fare ricerca in diversi settori della genetica e della biologia molecolare. In ambito forense, l’introduzione della PCR ha rappresentato un punto di svolta fondamentale, permettendo di risolvere un problema molto ricorrente nelle indagini criminali: La scarsa quantità di DNA che può essere estratta da gran parte dei reperti.

Breve storia della genetica forense L’importanza della PCR in ambito forense CASE STUDY (2) Un vecchio caso di esclusione ottenuto mediante PCR: Glen Woodall 1987: Glen Woodall viene condannato a 355 anni di prigione per due diversi casi di violenza sessuale verificatisi nel parcheggio di un centro commerciale in West Virginia. Test su polimorfismi dei gruppi sanguigni ed enzimatici avevano rivelato un match tra il materiale biologico repertato ed il sangue prelevato all’accusato. La probabilità di match casuale era stata stimata essere pari a 6/10000. La difesa fece richiesta di un nuovo test basato sul DNA fingerprinting, ma questo si rivelò inconclusivo, per la quantità non ottimale del DNA repertato. Successivamente, la difesa fece richiesta di un nuovo test del DNA, questa volta basato sulla tecnica PCR. Il test confermò che il liquido seminale dei due casi di violenza proveniva dallo stesso aggressore, ma che il profilo genetico ottenuto era differente da quello di Glen Woodall. Nel 1992 G. Woodall venne discolpato ed indennizzato, dopo 5 anni di carcere.

Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA 1 Il sistema MHC (complesso maggiore di istocompatibilità, nell’uomo chiama HLA) è costituito da un insieme di proteine di superficie capaci di legarsi ad antigeni derivanti da patogeni e di esporli sulla superficie di cellule specializzate. Il sistema MHC è anche coinvolto nell’istocompatibilità e nelle malattie autoimmuni. I 240 geni MHC umani sono divisi in tre classi (I, II e III) e sono localizzati tutti in una regione di circa 3. 3 Mbasi sul cromosoma 6. Il gene DQA 1 appartiene alla classe II e codifica per la catena alfa del dimero DQ, coinvolto nell’immunità «extracellulare»

Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA I geni del sistema MHC sono tra i più variabili del genoma umano, per ovvie ragioni legate alla funzione delle proteine per le quali codificano Basi molecolari della variabilita’ dell ’ esone 2 del gene DQA 1, utilizzato in genetica forense nei primi anni ’ 90 come sistema altamente polimorfico analizzabile mediante PCR

Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA 1 La tecnica (reverse dot blot) 1) Amplificazione mediante PCR dell’esone 2 ipervariabile del gene DQA 1 (circa 200 bp). I primers sono marcati con biotina. 2) Ibridazione del prodotto PCR con oligo «allele specifici» fissati su una strip di membrana di nylon. 3) Lavaggio ad elevata stringenza: rimangono sulla membrana solo i prodotti PCR con sequenze perfettamente complementari ai relativi oligo. 4) Rivelazione mediante sistema streptavidina/biotina

Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA 1 Nel sistema «Amplitype DQ- » erano presenti inizialmente 9 sonde in grado di distinguere 6 alleli, per un totale di 21 differenti genotipi (pannelo “a” in figura) Un kit prodotto successivamente (Polymarker) permetteva di discriminare un ulteriore allele in DQA (4. 1 vs 4. 2, 4. 3) e al tempo stesso permetteva di conoscere il genotipo di altri 5 sistemi polimorfici, due triallelici e tre biallelici (pannello “b” in figura, dove è mostrato il genotipo per una linea cellulare -9948 - utilizzata come standard). Vantaggi e svantaggi: - Metodo semplice e rapido - Elevata sensibilità (PCR) - Potere di discriminazione relativamente basso (circa 1/10000)

Breve storia della genetica forense 1994: Il minisatellite D 1 S 80 (un minisatellite amplificabile mediante PCR) L’introduzione del kit Amplitype D 1 S 80 rispondeva a due esigenze fondamentali in ambito genetico forense: -La possibiltà di analizzare quantità minime di DNA mediante PCR -La necessità di avere a disposizione marcatori multiallelici e caratterizzati da un elevato grado di eterozigosità (maggiore dei sistemi DQA 1). Il minisatellite presenta unità ripetitiva di 16 basi (corta per essere un minisatellite) con più di venti alleli caratterizzati da un numero di ripetizioni nel range 14 -41. L’intero prodotto PCR varia da circa 400 bp (alleli più corti) a circa 800 bp (alleli più lunghi).

Breve storia della genetica forense Il minisatellite D 1 S 80 (un minisatellite amplificabile mediante PCR) Vantaggi e svantaggi: -Metodo relativamente semplice (PCR + elettroforesi) -Elevata sensibilità (PCR) -Potere di discriminazione elevato (per un singolo locus) -La presenza di alleli multipli facilita l’interpretazione delle «misture» -Range bp del prodotto PCR troppo grande (problemi con DNA degradato) -Difficoltà per l’analisi in multiplex e per l’automazione

Breve storia della genetica forense (fine ? ) 1995 -present: MICROSATELLITI L’introduzione dei microsatelliti in ambito forense verso la metà degli anni ’ 90 portò alla rapida «estinzione» dei marcatori utilizzati in precedenza. Dal 1995 ad oggi i microsatelliti autosomici sono rimasti i marcatori di elezione in ambito forense, ed è opinione diffusa (sebbene non da tutti condivisa) che lo rimarranno per sempre. Ciò nonostante, altri tipi di marcatori e sistemi polimorfici vengono oggi utilizzati in casi forensi specifici: - Variazione di sequenza del DNA mitocondriale - Microsatelliti del cromosoma Y e del cromosoma X - SNPs - indels Questi sistemi polimorfici e i microsatelliti, per la loro importanza nella genetica forense moderna, saranno trattati in dettaglio in lezioni dedicate

Breve storia della genetica forense Confronto tra sistemi polimorfici utilizzati in ambito genetico forense nel XX secolo (variabilità vs. rapidità analisi) High Multiplex microsatelliti Minisatelliti Multi-Locus Probes Power of Discrimination (Genetics) Minisatelliti Single Locus Probes PCR Southern blot mt. DNA Sequencing Low Slow minisatellite D 1 S 80 Singolo DQ microsatellite Polimorfismi ABO/gruppi proteici sanguigni Speed of Analysis (Technology) Fast Figure 1. 1, J. M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

In qualsiasi tipo di applicazione (forense, evolutiva, mappatura, diagnostica) che coinvolga dei marcatori genetici polimorfici sono disponibili (o sono stati disponibili) diversi tipi di marcatori. Storicamente, nelle diverse discipline alcuni marcatori sono stati preferiti ad altri, che sono caduti in disuso. La scelta dei marcatori si basa (o si è basata storicamente) su una serie di caratteristiche dei marcatori, che possono essere di tipo biologico o tecnico: • dimensioni • tasso di mutazione • grado di eterozigosità (potere di discriminazione) • numero di alleli • localizzazione nel genoma • numero di copie/cellula • stabilità biologica (proteine vs DNA vs RNA) Caratteristiche biologiche • sensibilità analitica • accuratezza • possibilità di analisi multiplex • possibilità di standardizzazione • tempi tecnici dell’esperimento • costi dell’attrezzatura • costi dell’esperimento Caratteristiche tecniche del metodo di analisi

Cos’è il tasso di mutazione? Numero di mutazioni per unità di tempo e di spazio Parlando di tasso di mutazione bisogna sempre specificare a cosa si fa riferimento: Tempo Tasso di mutazione per anno? generazione? divisione cellulare? Spazio Tasso di mutazione per: nucleotide? elemento variabile? genoma?

profilo microsatelliti profili minisatelliti

Parte 3 Focus sui microsatelliti (short tandem repeats, STRs) marcatori d’elezione in genetica forense

Natura molecolare dei microsatelliti I microsatelliti sono una classe di DNA ripetuto caratterizzato da un piccolo numero di ripetizioni corte in tandem. Sono comuni nel DNA nucleare di tutti gli eucarioti fino ad ora esaminati (circa 1/10 mila basi) Nei primati rappresentano circa 2% del genoma

Esempio di microsatellite utilizzato in ambito genetico forense: D 16 S 539

Natura molecolare dei microsatelliti perfetti composti interrotti I microsatelliti possono essere perfetti (o semplici), interrotti o composti. Alcuni microsatelliti che presentano diversi motivi e/o interruzioni vengono detti complessi (esempio SE 33). Vengono ulteriormente classificati in base alla composizione del motivo ripetuto (esempio GATA repeat) oppure alla lunghezza del motivo ripetuto: dinucleotide repeats (4 tipi possibili), trinucleotide repeats (10 tipi), tetranucleotide repeats (33 tipi), pentanucleotide repeats (102 tipi) ecc.

Distribuzione dei microsatelliti I microsatelliti sono distribuiti in modo abbastanza omogeneo nel DNA nucleare dove si ritrovano sia sugli autosomi che nei cromosomi sessuali. Nei primati rappresentano circa 2% del genoma. Non sono invece presenti nel mt. DNA umano

Mutazione nei microsatelliti L’elevato tasso di mutazione nei microsatelliti è dovuto a scivolamento della polimerasi in replicazione • Tasso di mutazione molto elevato: • 10 -2 – 10 -4 mutazioni/STR/generazione • La mutazione avviene generalmente per aumento o diminuzione di una singola unità ripetitiva • Mutazioni per aumento più frequenti di mutazioni per diminuzione • Il tasso di mutazione per ciascun microsatellite è positivamente correlato con la lunghezza dell’allele

Variabilità genetica dei microsatelliti • Il polimorfismo nei microsatelliti consiste nel diverso numero di copie del motivo semplice • Il numero degli alleli è generalmente compreso tra 4 e 40 • Il grado di variabilità dei microsatelliti è correlato positivamente con il numero di ripetizioni; microsatelliti corti sono in genere monomorfici • A causa dell’elevato tasso di mutazione, gli alleli dei microsatelliti uguali in stato spesso non sono uguali per discendenza • Microsatelliti interrotti in genere mostrano un grado minore di variabilità di microsatelliti perfetti di pari lunghezza • La mutazione nei microsatelliti generalmente non ha effetti fenotipici, ma in alcuni casi è causa di importanti malattie, in gran parte neurodegenerative (CORSO GENETICA UMANA - LM GBM)

I microsatelliti in ambito forense «Il microsatellite ideale» (nella genetica forense) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) Microsatellite con elevata eterozigosità (maggiore discriminazione) Microsatellite con range allelico contenuto (facilita multiplexing) Microsatellite amplificabile in corti prodotti PCR (per DNA degradato) Microsatellite i cui alleli siano ben separabili su gel (accuratezza) Microsatellite che presenti un ridotto fenomeno di stuttering Microsatellite con tasso di mutazione contenuto (x paternità) Microsatellite situato su autosomi (“indipendenza” statistica dei loci) Molte di queste caratteristiche si escludono vicendevolmente: (esempio: basso tasso di mutazione e elevata eterozigosità) Qual è un ragionevole compromesso? La comunità forense si è orientata principalmente su microsatelliti del tipo tetranucleotide repeats autosomici

I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. Pannello di 13 microsatelliti «core» (in giallo) secondo il CODIS, USA CODIS (Combined DNA Index System) Programma dell’FBI in supporto alla giustizia che si basa sullo sviluppo e l’utilizzazione di databases di profili genetici. In UK e alcuni altri stati Europei si utilizza un «core» di 10 STR, 8 dei quali in comune con il CODIS I 13 microsatelliti del CODIS furono scelti nel 1997 a partire da 17 loci candidati, in base alla loro variabilità e facilità di interpretazione dei risultati. I 13 loci sono tutti «tetranuceotide repeats» , sia semplici che composti. L’analisi dei 13 loci del CODIS porta a profili genetici la cui probabilità di random match è minore di 1 su un miliardo di milioni (10 -15).

I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. I kit commerciali sviluppati da Applied Biosystems (a sinistra) e Promega (sotto) permettono di amplificare i 13 STR «core» del CODIS più alcuni altri STR. I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense (maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc. )

I microsatelliti in ambito forense I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense (maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc. )

Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) Necessità di fare riferimento ad una nomenclatura univoca permettere il confronto tra laboratori e con i diversi database Nomenclatura degli alleli: (1) Scelta del filamento - Se il microsatellite è in un gene, si prende in considerazione il filamento codificante - Se il microsatellite non è in un gene, si prende in considerazione il filamento corrispondente alla sequenza originariamente descritta in letteratura e riportata in un database pubblico. La direzione di lettura è sempre, ovviamente, 5’-3’ 1 2 3 4 5 6 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 6 5 4 3 2 1

Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) (2) Nome del motivo ripetuto. Nell’esempio riportato sotto, potremmo parlare di un microsatellite di tipo (TCAT)n oppure (CATT)n oppure (ATTC)n o ancora (TTCA)n (TCAT)n 1 2 3 4 5 6 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 6 5 4 3 2 1 La scelta ricade sul primo motivo ripetuto «utile» incontrato partendo dal 3’ del filamento scelto secondo il criterio visto in precedenza. Nell’esempio sopra quindi si sceglierà (TCAT) E’ importante osservare che la scelta del filamento e/o del motivo ripetuto potrebbe condizionare il numero di repeats conteggiate con importanti implicazioni per la ricerca di match in database. Nell’esempio sotto, allele (AAAT)8 oppure (TAAA)9 ? 5’ AAAATGCACTAAATAAATAAATAAATAAACAAA

Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) (3) «Microvarianti» o interalleli. Alleli con motivi ripetuti incompleti devono includere il numero di ripetizioni complete e, separate da un punto, il numero di basi nella ripetizione incompleta. Esempio: Allele 11. 3: ctcc GATA GATA GATA GATA ctcg Esempio di interallele 11. 3 al locus D 2 S 441 NOTA: Poiché con i metodi standard di analisi degli STR (elettroforesi capillare) il numero di repeats si deduce dalla lunghezza complessiva dell’amplicone, può accadere che un interallele sia dovuto ad inserzione/delezione nella sequenza dell’amplicone fiancheggiante il STR, piuttosto che nell’STR stesso.