Generalidades de Nutricin y Metabolismo de los Protozoarios

Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

Nutrición • Dependencia metabólica del hospedero • Capacidad biosintética limitada • Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies • Single omission tests: difícil sacar conclusiones • Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutrición - Mecanismos • Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas • Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad • Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración • Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

Glúcidos • Transporte mediado en membranas celulares • T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina • T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol • E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitante • Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en Trypanosoma brucei. • El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei. • Gal está presente en cantidades importantes en las VSG • Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDPglucosa 4´epimerasa (gal. E).

Glicoconjugados de superficie en Trypanosoma brucei

Mutante condicional null para gal. E • Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal. • Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de gal. E • Después de 96 h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar. Scanning electron microscopy of gal. E-c. KO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos (A) Growth of gal. E-c. KO with and without Tet (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the gal. E-c. KO without Tet (C) Sugar nucleotide levels of the gal. Ec. KO Tet cells. • Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

Aminoácidos • • Translocación – mediada en su gran mayoría Endocitosis de proteínas. T. brucei: 4 sitios operativos T. cruzi: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala • Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii • En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato • T. gondii carece del gen de la CPSI • Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48 hs medio normal B: 48 hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

Hemoglobina · 95% de las proteínas totales de GR · Abundante (>300 mg/ml o approx 5 m. M) · 60 -80% es degradada durante el estadio eritrocitario · 110 g (en un total de 750) se consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%

Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitario cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

Vacuola Digestiva Un lisosoma especializado digestion de hemoglobina Camino endocítico ATP H+ (p. H 5 -5. 4) Proteasas de la vacuola • plasmepsinas I & II (aspártico) • falcipainas I - III (tiol) • falcilysinas (metallo) ADP citoplasma parasitario

El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb • Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α) a-F 33/L 34 í – ‘región bisagra’ – conservada – Importante para estabilizar el tetrámero • Se forman fragmentos grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior – Se libera Heme

La digestión de la Hb es un proceso ordenado hemoglobina plasmepsina fragmentos de + heme globina grandes • Exopeptidasa? • Amino acidos libres? falcipaina plasmepsina fragmentos medios Fragmentos chicos falcilysina (6 -8 aa) (20 aa)

La vacuola Digestiva de Plasmodium Un lisosoma especializado ATP hemoglobin H+ ADP proteins plasmepsin globin heme + fragments falcipain amino acids plasmepsin aminopeptidase falcilysin ATP small fragments (6 -8 amino acids) Pfmdr-1? ADP

El Heme libre es tóxico • Desestabiliza y lisa membranas • Las hidrolasas se liberan en el citoplasma del parásito • El parásito muere Posible Mecanismos de Detoxificación • heme hemozoína (pigmento malárico) • Degradación mediada por H 2 O 2 o GSH • heme oxigenasa (sólo P. b. and P. k. )

Hemozoína = b-Hematina heme b-hematina

b-hematina forma cristales insolubles 'biocristalizacion' or 'biomineralización'

La vacuola digestiva Un lisosoma especializado ATP hemoglobin O 2 Fe 3+ -O O 2 2 · Fe se oxida después de liberarse de la Hb · La oxidación promueve la formation of ROI · Estrés oxidativo H+ plasmepsin Fe 2+ globin heme + fragments falcipain ? hemozoin plasmepsin falcilysin small fragments Pfmdr-1? (6 -8 amino acids) ADP amino acids aminopeptidase ATP ADP

Nucleótidos • No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo • Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos • En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina • Locus para transporte de nucleósidos • Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie • Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

Transportadores de purinas en Plasmodium

Vías de salvataje de purinas en parásitos

Lípidos • Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados • Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora • Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria • Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS Generalidades Objetivos del metabolismo energético • a) Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía • b) Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

Esquema de Metabolismo Energético

KINETOPLASTIDOS • Trypanosoma brucei como modelo: • a) Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol • b) Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes • c) Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma • d) Flujo glicolítico es relativamente alto • e) Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

Glicólisis • Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0. 3 um, 4% del volumen celular. T. brucei=200. • Glicólisis: De Glu a 3 fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3 GP a 3 PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO 2 y Glicerol- Fermentación G 3 P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O 2 dentro de la mitocondria • Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1 ATP por 1 Glucosa. • Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma. • Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO 2, ALA y ASP

Glicólisis y glicosomas •

Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de T. brucei

Amebas Intestinales y Giardia • Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO 2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol • Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa • Sin citocromos • Almacenan glucógeno • Toleran bajas concentraciones de oxígeno

Glucolisis

Glucolisis anaerobia

Mitosomas - Descrito en E. histolytica, G. lamblia - El origen mitocondrial del mitosoma está apoyado por: - i) Doble membrana - ii) localización de proteínas de la maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina) - iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales

Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica

Trichomonas • Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO 2 y H 2 O • La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones • La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

Hidrogenosomas • Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular • 1 um, doble membrana • Comparten ancestro con mitocondrias • Tricomonas, ciliados anaerobios, hongos

CO 2 hsp 70 ME Pyruvate Malate Transit peptides NAD(P)H NAD(P)+ [Fe]Hyd ATP ADP H 2 2 Fd- 2 H+ Co. ASH ASCT Acetate Acetyl-Co. A PFO CO 2 Fungi and Trichomonas Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Unknown ancestry AAC N NAD(P)-FO 2 Fd cpn 60 Protein import Succinate Succinyl-Co. A STK ATP Double membrane ADP + Pi Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)

Generación de ATP en Hidrogenosomas

Acidocalsomas Organelos ácidos Almacenan calcio En varios microorganismos Primero definidos en tripanosomátidos Alta densidad electrónica Alta concentración de fosfatos, Ca++. , Mg++

Apicoplastos -Organelo cloroplasto-símil -Vias biosintéticas de origen cianobacteriano -Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote -En Apicomplexa -Semiautónomos, genoma propio reducido