Gene Xpert MTBRIF Gene Xpert MTBRIF teste que

Gene. Xpert MTB/RIF

Gene. Xpert MTB/RIF • teste que utiliza a plataforma Gene. Xpert (Cepheid) • permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpo. B) • baseado na técnica de PCR em tempo real

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) • Um das principais ferramentas de biologia molecular • Desenvolvida por Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química

Importância dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) na síntese de DNA

Temperatura 100 Melting 94 o. C PCR 50 0 T e m p o 3’ 5’ 5’ 3’

Temperatura 100 Melting 94 o. C PCR 50 0 T e m p o 3’ 5’ 94ºC 5’ 3’

Temperatura 100 Melting 94 o. C 50 PCR Anelamento Extensão 72 o. C Melting 94 o. C 50 o. C 0 T e m p o 3’ 5’ 5’ 3’

Temperatura 100 Melting 94 o. C 50 PCR Anelamento Extensão 72 o. C Melting 94 o. C 50 o. C 0 T e m p o 3’ 5’ 94ºC 5’ 3’ 30 x

Temperatura 100 Melting 94 o. C 50 PCR Anelamento Extensão 72 o. C Melting 94 o. C 50 o. C 0 T e m p o 3’ 5’ 5’ 3’ 30 x

Temperatura 100 50 0 Melting 94 o. C PCR Anelamento Extensão 72 o. C Melting 94 o. C 50 o. C T e m p o 5’ 94ºC 5’ 30 x

Temperatura 100 50 0 Melting 94 o. C PCR Anelamento Extensão 72 o. C Melting 94 o. C 50 o. C T e m p o 5’ 5’ 30 x

Temperatura 100 Melting 94 o. C 50 0 PCR Anelamento Extensão 72 o. C 50 o. C T e m p o 5’ Fragmentos de tamanho definido Melting 94 o. C 5’ 5’ 30 x

Mais Ciclos = Mais DNA Número de ciclos 0 10 15 20 25 30

Amplificação 30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas Permite aumentar a quantidade de uma determinada amostra Pode aumentar a quantidade de um contaminante

DNA polimerase de E. coli Klenow (derivada da DNA Pol. I de E. coli) anelamento extensão desnaturação DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável

Breve Histórico • O primeiro termociclador foi desenvolvido na Cetus Corp. – Mr Cycle • Projetado para que a DNA polimerase pudesse ser adicionada a cada ciclo

Yellowstone National Park

DNA Polimerase Termoestável • 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

• Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo a primeira DNA polimerase termoestável Taq DNA polimerase (1976)

Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC

Kary Mullis Prêmio Nobel de Química em 1993

Componentes de uma reação de PCR 1. Template (molde) (1– 500 ng). 2. Primers (0. 05– 1. 0 μM). 3. Mg 2+ (0. 5– 5 m. M). 4. d. NTP (20– 200 μM cada). 5. 1× PCR buffer 6. DNA polimerase (0. 5– 2. 5 U para cada 50 μL de reação).

PCR “padrão” Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA - Clonagem gênica - Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ, . . . ) - Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)

CURVA DE PCR

Gene. Xpert (Cepheid)

Gene. Xpert (Cepheid)

Gene. Xpert MTB/RIF

Avaliação dos módulos

Preparação da amostra

Cartucho Gene. Xpert MTB/RIF

Identificação do Cartucho Gene. Xpert MTB/RIF Manual Automática

OPÇÕES DE UTILZAÇÃO

Cancelamento de teste(s)

Resultado – Amostra 1

Resultado – Amostra 2

Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose • Métodos bacteriológicos -Baciloscopia -24 hs . Métodos Moleculares - Fita Hain 3 dias ou mais (baciloscopia positiva +) -Cultivo – MGIT – 10 dias - Genexpert -2 hrs - Sólido – 30 dias - Teste de Sensibilidade - MGIT -15 dias - Método das Proporções 28 a 42 dias

Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose Vantagens e Desvantagens -Bacteriológico - Mais barato (baciloscopia) - TSA Mais demorado (MGIT) - Outras drogas (INH, etc. ) - Bacilos vivos - Moleculares(Genexpert) - Mais caro - Mais rápido Rif resit - Só para Rif - Bacilos Vivos e “mortos” - Cultivar para TSA confirmatório e outras drogas (quantidade de escarro) - Triagem - Três códons relacionados a resistência a RIF - Não detecta em amostras extra-pulmonares - Não detecata MNT