Gene reporter Watson et al BIOLOGIA MOLECOLARE DEL

Gene reporter

Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S. p. A. Copyright

I promotori eucariotici sono costituiti da una associazione variabile di “box” -140 -120 -100 -80 -60 SV 40 (promotore precoce) Timidina kinasi Istone H 2 B Ottamero CAAT GC -40 -20 1 10

Attivatori costitutivi Modulo Attivatore DNA occupato Consenso Distribuzione CAAT box CTF/NF 1 22 bp GGCCAATCT ubiquitaria GC box SP 1 20 bp GGGCGG ubiquitaria Ottamero Oct-1 20 bp ATTGCAT ubiquitaria Ottamero Oct-2 23 bp ATTGCAT linfoidi k. B NFk. B 10 bp GGGACTTTCC ubiquitaria ATF 20 bp GTGACGT ubiquitaria

Attivatori inducibili e elementi di risposta Agente regolatore Elemento di risposta Consenso Fattore Dimensioni (dalton) Shock termico HSE CNNGCCNNTCCNNG HSTF 93. 000 Glucocorticoidi GRE TGGTACAAATGTTCT GR 94. 000 Cadmio MRE CGNCCCGGNCNC TPA TRE TGACTCA AP 1 39. 000 Siero SRE CCATATTAGG SRF 52. 000

Esempio di promotore

Enhancers § Similar sequence elements are found in enhancers and promoters. § Enhancers form complexes of transcription factors that interact directly or indirectly with the promoter.

Funzionamento degli enhancer

L’enhancer può funzionare in trans

Ruolo degli Isolatori

LCR and insulators § An LCR is located at the 5' end of the domain and consists of several hypersensitive sites. § Insulators are specialized chromatin structures that have hypersensitive sites. § All known insulators are able to block passage of any activating or inactivating effects from enhancers, silencers, or LCRs. § In some cases, insulators have directionality, and may stop passage of effects in one direction but not the other.

Fattori di trascrizione negli eucarioti (trans-acting factors = fattori che agiscono in trans ) Possono essere distinti in: - Fattori generali - Fattori specifici (attivatori)

Complesso di inizio su un promotore Pol II 1 TBP + vari TAF -5 0 -4 0 -3 0 -2 0 TATA TFII D TATA TFII B TFIIF Pol II TFII E Pol -1 0 1 10 20

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

Attivazione della trascrizione

Complessi basali delle RNA polimerasi eucariotiche

Initiation at pol II promoters ¨ Binding of TFIID to the TATA box is the first step in initiation. ¨ Other transcription factors bind to the complex in a defined order, extending the length of the protected region on DNA. ¨ When RNA polymerase II binds to the complex, it initiates transcription.

Later events of pol II initiation ¨ TFIIE and TFIIH are required to melt DNA to allow polymerase movement. ¨ Phosphorylation of the CTD may be required for elongation to begin. ¨ Further phosphorylation of the CTD is required at some promoters to end abortive initiation. ¨ The CTD may coordinate processing of RNA with transcription.

Fattori di trascrizione negli eucarioti (trans-acting factors = fattori che agiscono in trans ) Possono essere distinti in: - Fattori generali - Fattori specifici (attivatori)

Struttura“modulare” degli attivatori trascrizionali • legame al DNA • transattivazione • dimerizzazione • legame al ligando

Strategia per lo studio degli attivatori

Struttura degli attivatori

Domini (moduli) degli attivatori

Scambio di domini (attivatori chimerici)

Scambio di domini N h. GR h. ER Recettore “chimera” modulatore DNA ligando C

Combinazioni di omodimeri ed eterodimeri

Domini di dimerizzazione

Domini di attivazione • Domini acidici: es. GAL 4 • Domini ricchi di glutammine: es. Sp 1 • Domini ricchi di proline: es. CTF

Famiglie di fattori di trascrizione • Domini a zinco • Omeodominio (elica-giro-elica) HTH • Elica-ansa-elica HLH • Cerniera di leucina

Coattivatori della trascrizione

Complesso del mediatore Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.

Complesso d’inizio di pol II

Modelli dell'oloenzima

RNA pol II holoenzyme ¨ Includes pol II, GTFs, Srb/Mediator complex ¨ Exists in more than one form ¨ Can initiate transcription and respond to activators

Regolazione negativa

Regolazione degli attivatori

Trasduzione del segnale dalla membrana al nucleo

Le vie delle MAP chinasi

Trasduzione del segnale dalla membrana al nucleo