GEN HARTALAMA Prof Dr Nurten Kara Tbbi Biyoloji

GEN HARİTALAMA Prof. Dr. Nurten Kara Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı

• Gen haritalama kısaca hastalıkların genetik temelinin araştırılmasıdır. Genlerin kromozomlar üzerinde bulunduğu yerlerin (lokus) gösterilmesidir. Bir başka tanımlama, hastalıktan sorumlu gen veya genlerin tanımlanmasıdır.

Klasik Gen Haritalama Yöntemleri 1. Sitogenetik haritalama 2. Genetik haritalama 3. Fiziksel haritalama

Sitogenetik Haritalama • Sitogenetik bantlama teknikleri ile kromozomları ayırdetmek kolaylaşmıştır. Ayrıca sub kromozomal bölgelerin, FISH yöntemi ile hibridizasyonundan sonra elde edilen bir sinyal prob ile tanınan DNA dizisinin lokalizasyonunun tanımlanması sağlanabilir. • Kromozomal olmaktadır. yeni düzenlenmeler de haritalamada yardımcı • Somatik hücre hibrid çalışmaları ile de kromozomlar ve onlar üzerindeki genlerin haritalaması yapılmıştır. Somatik hücre hibridizasyon yöntemi ile ilk gen haritalaması, timidin kinaz enzim geni lokusunun 17 nolu kromozom üzerinde olduğunun gösterimesi ile gerçekleşmiştir.

Genetik Haritalama • Kısaca genomun matemetiksel analizi olarak bilinir ve genlerin kromozomlar üzerinde lokalizasyolarının bulunmasında moleküler biyolojik yöntemler ve uygun istatistik analizler kullanılır. • Metod en genel anlamı ile kromozom üzerinde yeri aranan gen ile yeri bilinen bir genetik belirleyicinin (marker) kuşaklar arasında birlikte kalıtılmasının test edilmesi esasına dayanır.

• Mayoz bölünmede, kromozomlar arasında parça değişimi (krossing over) sonucunda birbirine yakın olan genler sıklıkla birlikte giderler. Uzak olan genler ise bağımsız tertiplenme kuralına göre rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar. Bu olaya rekombinasyon olayı, ortaya çıkan ürünlerede rekombinant ürünler adı verilir.

• Rekombinasyon kavramı genetik haritalamanın temelini oluşturur. Eğer kromozom üzerinde yeri bilinen marker aranılan gene çok yakınsa mayozda birbirlerinden ayrılmayacak ve kuşaklar boyu daima marker allel ile birlikte kalıtılacaktır. Başka bir deyişle yavru kuşaklarda rekombinant bireylerin fazla sayıda bulunması aradığımız genden uzaklaştığımız anlamına gelecektir. Bu yolla diyelim ki marker allelin yeri kromozom 2 p 13 bandında ise ilgilendiğimiz genin ya da hastalığın yeri de bulunmuş olacaktır.

• Rekombinasyon birimi santimorgan (c. M) ile ifade edilir. Genellikle 1 c. M uzaklık: 1 milyon bç’ ne karşılık gelmektedir. • Bu metod ile gen haritası yapmak için kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyaç vardır. Ailelere bakarak kalıtım kalıbı ( tek gen , kompleks, mitokondriyal) çıkarılır.

Genetik etkenlere bağlı olduğu düşünülen bir hastalığın gen haritasının yapılması: 1. Hastalığın, genin, ya da karakterin özelliklerinin standartlar oluşturularak saptanması. Bunun için çok sayıda aileden toplanmış örneklere ihtiyaç vardır. 2. Kalıtım kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir

Gen haritalamada iki metod uygulanır A) Parametrik metodlar Temel olarak linkage (bağlantı) analizleri olarak bilinir. Linkage analizinin başarılı olması için; 1. Kalıtım kalıbı kesin olarak bilinmelidir 2. En az üç kuşaklı geniş aileler tercih edilir. Pedigri analizi yapılmadan sadece sporadik vakalar üzerinden linkaj analizi yapmak mümkün değildir. 3. Örnek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına göre olmalıdır.

4. Haritalamada kullanılacak marker’lar doğru olarak seçilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak kullanılmalıdır. 5. İstatistik değerlendirmeler metoda göre seçilmelidir: Linkaj analizi için LOD skor (Logaritm of Odds Ratio) analizi uygundur. LOD skor bağlantı gözlenmesi olasılığının bağlantı gözlenmemesi olasılığına oranının logaritmasıdır. Çıkan değer arttıkça lokalizasyonun saptanması olasılığıda artacaktır. LOD skor=3 ve üstü değerler bağlantıyı desteklemesi açısından anlamlı kabul edilirken 2 ve giderek negatifleşen değerler kesin olarak bağantı olmadığını gösterir.

B) Non-parametrik metodlar: Hastalığın veya bir karakterin kalıtım kalıbını belirlemek her zaman kolay olmayablir. Pek çok özellik multifaktöriyel kalıtımlıdır. Özellikle hastalığın geç yaşta gözleniyor olması ve önceki kuşakların ölmüş olması gibi nedenlerden dolayı parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar olan assosiasyon çalışmaları uygulanır.

• Assosiasyon çalışmaları için çok sayıda vaka-kontrol incelenmeli ve incelenen nitelik açısından karşılaştırma yapılarak anlamlı fark olup olmadığı istatistik olarak test edilmelidir.

FİZİKSEL (MOLEKÜLER) HARİTALAR • Genomik DNA’nın klonlanmış parçalarının düzenlenmesi ile oluşturulurlar ve baz çifti sayılarına göre ayarlanmışlardır. Genetik haritadan farkı, direkt olarak DNA’yı oluşturan bazların sırası belirlenmiştir. Böylelikle genlerin fiziksel yapıları kesin olarak ortaya konabilmektedir. Haritalama projelerinin en son aşamadaki amacı olan fiziksel harita en yüksek rezolüsyona sahiptir.

GÜNÜMÜZDE TANIMLANAN GEN HARİTALAMA YÖNTEMLERİ • Gen haritalama için üç farklı uygulama vardır; • Bağlantı analizi (linkage analysis) • İlişkilendirme analizi (association anly. ) • Genom dizileme

Bağlantı Analizi • Bağlantı analizi (linkage analysis) aile temellidir. Hastalık ailesel geçiş (otozomal dominant, otozomal resesif veya X’e bağlı kalıtım) gösteriyorsa; Soy ağacından yararlanma Özgül genomik bölgeler, spesifik varyant veya varyantların kullanımı

Bağlantı Analizi 2 • LOD skor (Logarithm of the ODds) analizi mendeliyen olarak kalıtılan hastalıklarda mutasyonların gerçekleştiği genlerin haritalanmasını sağlar. • LOD skor ile; • Hastalık lokusu ile marker lokus arasındaki rekombinasyon frekansı en iyi tahmin edilir. • LOD skor= 3’ün üzerinde ise kuvvetli bağlantı vardır.

Mayozda Bağımsız Dağılım ve Homolog Rekombinasyon Thompson and Thompson, Genetics in Medicine 7. Baskı, 2007

Farklı Kromozom Lokuslarındaki Allelerin Bağımsız Dağılımı Oluşan gametlerin %50’si atasal (DM veya dm) %50’si atasal değil rekombinanttır (Dm veya d. M). Thompson and Thompson, Genetics in Medicine 7. Baskı, 2007

Aynı kromozom lokusu üzerinde yer alan allelerin bağımsız ayrılması (aralarında en az bir krosover varsa) Atasal ve rekombinant gamet oranı %50’dir.

Rekombinasyon Frekansı ve Harita Uzaklığı • Lokuslar arasındaki uzaklığın ölçülmesi için rekombinasyon frekansı kullanılır.

Assosiasyon Analizi • İlişkilendirme çalışması ( association analysis): toplum (populasyon) temelli • Bu tip çalışma doğrudan pedigri üzerinden yapılan bir çalışma değildir. • Aynı populasyon içinde hasta ve kontrol grubu karşılaştırılarak özgül bir allel veya allel setlerinin frekanslarındaki artma veya azalma tespit edilir. Bu çalışmalar özellikle Mendeliyen kalıtımın gözlenmediği kompleks hastalıklar için yapılır.

Assosiasyon analizi için uygulanan yöntemler • Vaka-Kontrol çalışmaları: Populasyonda hastalıklı bireyler ve sağlıklı kontroller eşleştirilerek (yaş ve cinsiyet vb) yapılır. Elde edilen genotip ve allellerin frekansları ikili tablolarda Kİ-kare analizi yapılarak karşılaştırılır. • Odds ratio %95: güven aralığında 1 ise mutasyonun hastalıkla ilişkisi yoktur. • OR= 2 ve üzerinde ise mutasyon veya varyasyonun hastalık için iki kat risk oluşturmaktadır denilir.

• Cross-sectional (kesitsel) veya Cohort (topluluk) çalışmaları: Populasyonda özgün bir hastalık için seçilen kesitsel veya uzun zamandır takip edilen hastalar seçilir. Hastalıklı bireyler ile hastalık olmayan bireylerin genotip veya haplotipleri ikili tabloda değerlendirilir. Bunun için daha çok relative risk (RR) hesaplanır.

İkili Tablo (Two by Two Table) Hasta Kontrol Toplam Genetik marker (+) (Hastalık) a b a+b Genetik marker (-) c d c+d Toplam a+c b+d Genetik marker; allel, genotip veya haplotip olabilir

Odds Ratio hesaplanması • OR= (axd)/(bxc) • OR=(a/b)/(c/d) • RR= (a/a+b)/(c/c+d)

CVT’li Hasta Kontrol Total 20210 G>A 23 4 27 20210 G>A 97 116 213 Total 120 240 CVT: Cerebral vein thrombosis OR=(23/4)/(97/116)=6. 9 %95 (2. 3 -20. 6)

Genom Dizileme • Üçüncü uygulama etkilenmiş bireyler, ebeynleri ve ailedeki diğer bireyler veya populasyona doğrudan genom dizileme yapmaktır. Haritalamada sağlıklı referans genom kullanılarak yapılan yeni bir teknolojidir. • Bu uygulama özellikle bağlantı analizinin mümkün olmadığı nadir Mendeliyen hastalıklar için yapılır. Çünkü bağlantı analizi yapmak için yeterli sayıda aile bireyleri yoktur veya hastalık letaldir ve daima yeni mutasyonlardan kaynaklanır ve asla kalıtılmaz. • Bu durumda etkilenmiş bireyden genom dizileme veya kodlayan her genin exon dizilemesi yapılarak hastalıktan sorumlu gen bulunur.

SONUÇ Genlerin ve diğer genetik markırların kromozomlar üzerinde diziliş sırasının belirlenmesi ile kromozom haritasını veya tüm genom haritasını çıkarmak mümkündür. Bu üç yöntem kullanılarak hastalıklara neden olan genlerin tanımlanması, pek çok hastalığın patogenezi, patofizyolojisini anlamamıza olanak sağlamıştır. Günümüzde hastalığa neden olan genetik etkenin belirlenmesi hastalığın önlenmesi, yönetimi ve tedavisinde yeni yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.