Gasphasensequenzer Nterminale Sequenzanalyse EDMANABBAU Zyklischer Prozess letzte Nterminale

Gasphasensequenzer N-terminale Sequenzanalyse

EDMAN-ABBAU • • Zyklischer Prozess letzte N-terminale Aminosäure abgespalten + identifiziert • Reaktion aus 3 Schritten: 1) Kupplung 2) Spaltung 3) Konvertierung

KUPPLUNG • Edman-Reagenz: Phenylisothiocyanat PITC an freie Nterminale Aminogruppe gekoppelt. • bei 40 -55 Grad / ca. 15 -30 Minuten • Addition nur an unprotonierte Aminogruppe • p. H ca. 9 durch alkalische Puffer

KUPPLUNG PTC = disubstituierter Thioharnstoff (Phenylthiocarbamoylpeptid PTC)

KUPPLUNG • Nebenreaktion: alkal. katalysierte Hydrolyse v. PITC zu Anilin. - Anilin mit freier Aminogruppe mit PITC zu Diphenylthioharnstoff (DPTU) = Nebenprodukt des EA

NEBENREAKTION DPTU = Diphenylthioharnstoff

KUPPLUNG • Unpolares Lösungsmittel (z. B. Essigsäureethylester) löst DPTU von Protein/ PTC – Gemisch heraus (Protein=hydrophil, löst sich nicht)

SPALTUNG • wasserfreie Säure (z. B. Trifluouressigsäure) zum getrockneten PTC-Peptid = nucleophiler Angriff d. Schwefels an der Carbonylgruppe d. 1. Peptidbindung Ø Abspaltung der 1. AS (Heterozyklisches Derivat: Anilinthiazolinon (ATZ)-AS)

SPALTUNG Anilinthiazolinon (ATZ-AS)

SPALTUNG • S=nucleophil genug zur Ringbildung, O kann nur kuppeln, keinen Ring bilden • Inertgasatmosphäre, verhindert Austausch S O • Abdampfen der flüchtigen Säure

SPALTUNG • Kleine relativ hydrophobe ATZ-AS mit hydrophoben Lösungsmittel extrahiert (Chlorbutan, Essigsäureethylester) Anderes Löslichkeitsverhalten der AS als Peptid

KONVERTIERUNG • ATZ- Aminosäure = instabil wird in stabiles Derivat Phenylthiohydantoin (PTH-AS) Aminsäure umgewandelt. • ATZ-AS mit wässriger Säure geöffnet • bei erhöhter Temperatur zur stabileren PTH -AS umgelagert.

KONVERTIERUNG PTH-AS = Phenylthiohydantoin-Aminosäure

KONVERTIERUNG • Peptid (um 1 AS gekürzt) getrocknet Ø Neuer Reaktionszyklus PTH-AS chromatographisch im Vergleich zur Referenzprobe mit allen bekannten AS identifiziert + quantifiziert.

IDENTIFIZIERUNG Identifizierung der Aminosäuren: • PTH-AS = typisches Absorbtionsspektrum: 269 nm e=33. 000 mol – 1 • Bestimmungsgrenze (noch sicher quantifizierbar) = 1 pmol (mit chromatographischen Methoden)

EDMAN-ABBAU • Seit 1950 Versuch Edman-Abbau in Empfindlichkeit zu steigern. fluoreszierende Isothiocyanate als Kupplungsreagenzien ABER keine bessere Reaktionsausbeute • Allgemeines Problem: Trennung der normalerweise großen und sich durch Fluorophor chromatographisch ähnlich verhaltenen fluoreszierenden ASDerivaten

EDMAN-ABBAU • Neben chromatographischen Identifizierungen auch Massenspektroskopie (MS) • Ethylen-N, N, N trimethylamino-phenylisothiocyanat als Kupplungsreagenz (guter Nachweis mit MS) • Tsugita: statt Hydrolyse (Konvertierung) = Aminolyse - Einsatz von fluoreszenzmarkierten AS - Nachweis bis in Attomol-Bereich! ABER: Reaktionsbedingungen schwierig

AUSBEUTE Qualität: • Repetitive yield • Problem: Anzahl der pro Zyklus vollständig abgebauten Polypeptide nehmen rapide ab. • Nach einigen Abbauschritten sogar größere Anzahl unvollst. abgebauter Moleküle Komplexes PTH-AS Gemisch PTH-Analyse schwierig

AUSBEUTE • Sequenzierungsgrenze: 15% der eingesetzten Peptidmenge • je später 15% Grenze erreicht, desto längere Sequenz erhalten. • heutige Ausbeute (Automatisierung des Edman Abbaus) mehr als 90% (ca. 95% = 30 -40 AS)

AUSBEUTE Repetitive Yield

EDMAN-ABBAU • 1967: Automatisierung: Verluste beim manuellen Hantieren vermindert • 1000 fache Empfindlichkeitssteigerung von ca. 100 nmol Ausgangsmaterial auf heute 10 pmol durch: Umstellung von Dünnschichtchromatographie auf Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) techn. Verbesserung der Automaten Gasphasensequenzierung

SEQUENATOR Edman-Sequenator: • Lösungsmittelfördereinheit (transportiert Lösungsmittel + Reagenzien durch NDruck über elektronisch aussteuerbaren Ventilblock zum Reaktionskompartiment) • dort Kupplung und Spaltung • abgespaltete ATZ-AS in gekühlten Fraktionskollektor gesammelt • Konvertierung und Identifizierung offline

SEQUENZER • Moderne Sequenzer ähnlich: 1976 Wittmann-Liebold = automat. Konvertierung -ATZ-AS in Gefäß -dort Konvertierung -PTH-AS Identifizierung online • Reaktionskompartiment geändert, soll Protein immobilisieren Kontrolle der Reaktion

SEQUENATOR Aubau des Edman-Sequenators

PROBLEM • Problem: Proteine in vielen Lösungsmitteln oder Reagenzien des Edman-Abbaus (Base, Säure) gut löslich. • Reagenzien, die Auswaschen des Proteins verhindern

SEQUENZER (1) Spinning Cup Sequenator (2) Festphasensequenzer (3) Gasphasensequenzer (4) Biphasischer Säulenreaktor Spinning Cup Sequenator: rotierender Becher, Zentrifugalkraft hält Protein an der Wand Festphasen-Sequenator: Protein über ASSeitenkette o. freies C-Ende an Matrix (Polystrol, Glas) gebunden >96% Ausbeute, Nachteil: gebundene AS nicht sequenziert

SEQUENZER Biphasischer Säulenreaktor: Reaktionskompartiment aus 2 chromat. Säulen 1. Reversed-Phase: bindet Protein in wässrigen Lösungsmitteln 2. Silikal: bindet Protein in organ. Lösungsmitteln Säure/Base: Silikalsäule Reversed-Phase Org. Lösungsmittel: Reversed-Phase Silikalsäule -für die Extraktion von kleinen hydrophoben Nebenprodukten, >95% Ausbeute

SEQUENZER Gasphasensequenzer: 1981 von Hewick • Protein auf chemisch inerte Glasfritte appliziert (evtl. mit Trägersubstanz, z. B. Polybren) • beide Reagenzien, in denen aufgetragenes Protein löslich ist (Base/Säure) = gasförmig gefördert Argon- oder N-Strom durch wässrige Trimethylaminlösung bzw. Trifluoressigs. , dann zur Reaktionskammer geleitet

SEQUENZER 1. im Reaktionskompartiment gewünschte Säure/Base Bedingungen, aber kein Auswaschen! 2. Reaktionsnebenprodukte und ATZ-AS in organ. Lösungsmitteln (flüssige Phase) extrahiert Protein darin nicht löslich • totvolumenfreie Ventilblöcke optimale Anpassung an geringe Proteinmengen (<100 pmol )

SEQUENZER Sonderform: Pulsed-Liquid –Sequenzer = Gasphasensequenzer, Säure in flüssiger Form, schnellere Spaltungsreaktion • erfordert genaue Dosierung, um Protein mit Säure zu benetzen, aber nicht wegzuspülen Verkürzung des Edman-Abbaus auf 30 min

SEQUENZER Reaktionskompartimente

PROBLEME Probleme bei der Sequenzanalyse a) Probleme der Probe b) Probleme der Sequenzierung - der Probe: • Probe muss N-Terminal einheitlich (rein) sein • Kontamination von Salzen, Detergentien, freien AS interferieren schon in kleinen Mengen mit Reaktionen des Edman. Abbaus oder verhindern Extraktion.

PROBLEME Gasphasensequenzer: • entsprechende Probenvorbereitung • letzter Schritt der Peptidreinigung möglichst salzfrei! (Reversed-Phase-HPLC unter flüchtigen Lösungsmitteln) • • adsorbtive Immobilisierung an hydrophobe Membran durch Elektroblot des Proteingels auf PVDF-Membran oder hydrophob modifizierte Glasfasern)

PROBLEME Probenaufgabe • Glas, Eppis mit >95% Ameisensäure behandeln, Proteine dürfen nicht binden! N-terminale Blockierung • kein freies N-Ende, keine Kupplung an Aminogruppe • ca. 50% aller natürl. Vorkommender Proteine = N-terminal modifiziert (Acetylierung, Formylierung) • kann selten enzym. oder chem. entfernt werden Fragmentierung, nur innere Sequenzen

PROBLEME Quantifizierung • nur 50% der eingesetzten Proteinmenge sequenzierbar • wenn geringere PTH-AS-Menge als erwartet: Proteinmenge weniger als vermutet Proteingemisch mit N-terminaler Blockierung, Verunreinigung

PROBLEME Probleme der Sequenzierung • AS durch aggressive Reaktionsbeding. des EA zerstört: kleine Nebenpeaks im HPLC-Chromatogramm • modifizierte AS durch basische/saure Reaktionsbdeingungen täuschen unmodifizierte vor! • Fehlinterpretation: von modifizierten AS keine Standards

PROBLEME • zunehmender Untergrund durch labilere Peptidbindung, bei Spaltung werden Aspartylbindungen weniger hydrolysiert (Spaltungsreaktion) freier N-Terminus Sequenzierung Detektion im HPLC-Chromatogramm • nicht gesamte Proteinmenge kann sequenziert werden! Anfangsausbeute: initial yield = ca. 50%

PROBLEME Reaktionszeit, Menge, Lösungsmittel, Durchflussgeschwindigkeit, Temperatur = großen Einfluss auf Qualität! Reinheit der Chemikalien: -strenge Qualitätskontrollen, sonst Störpeaks HPLC-Systems: (High Performance Liquid Chromatography) • für PTH-AS Trennung in hohem Empfindlichkeitsbereich = technische Schwierigkeiten

KONTROLLE Microbore-Trennsäulen • • ca. 1 pmol genaue Lösungsmittelgradienten und Temperaturen, damit PTH-Laufverhalten nicht geändert! Finanzielle und zeitliche Schäden bei falschen Sequenzen Als Kontrolle: MS, Kapillarelektrophorese

PREISE Gasphasensequenzierung • Analyse der 5 ersten Aminsäuren 350 € • Analyse der 6 bis 25 Aminsäuren 60 € • SDS PAGE Trennung und Übertragung auf PVDF 240 €