Fungo Aspergillus se desenvolve principalmente no milho MICOTOXINAS

Fungo Aspergillus se desenvolve principalmente no milho MICOTOXINAS “O índice de câncer hepático na África – grande consumidor de amendoim, um grão altamente contaminável – é 13 vezes maior que em outros países” (SANTURIO, 2004) “A presença da aflatoxina nos alimentos contribui sobremaneira para mais de um terço dos casos de neoplasias que tenha relação com a dieta” (CIB, 2004)

MICOTOXINAS “Conjunto complexo de substâncias tóxicas, produzidas por fungos, diferenciando-se das toxinas bacterianas por não terem natureza protéica nem serem imunogênicas”

HISTÓRICO 10 pragas do Egito – evidências de micotoxinas: morte dos primogênitos; Europa/Idade Média- Fogo de Santo Antonio : ergotismo (Claviceps purpurea); Rússia/séc. XIX: aleucia alimentar tóxica- angina, cefaléia, vômitos e, em casos mais graves, a leucopenia seguida de hemorragia e morte- tricotecenos do Fusarium (matou 100 mil russos); Inglaterra/1960: morte de 100 mil perus que comeram farinha de amendoim com toxinas procedente do Brasil. 1957 e 1968 - Nefropatia no leste europeu- alimentos com ocratoxina.

25% DA SAFRA MUNDIAL DE GRÃOS É PERDIDA EM FUNÇÃO DE FUNGOS E MICOTOXINAS Perda na produção de amendoim já foi de 50% por causa da aflatoxina Mais de 500 micotoxinas conhecidas e produzidas por cerca de 100 espécies de fungos pertencentes, principalmente, aos gêneros Aspergillus, Alternaria, Fusarium e Penicillium.

QUANDO, ONDE E COMO SÃO PRODUZIDAS? Produtos agrícolas estão sempre predispostos e susceptíveis à contaminação por micotoxinas durante: a colheita; a estocagem; o transporte; o processamento; a armazenagem. Ausência de fungos não implica na ausência de micotoxinas

A OCORRÊNCIA DE MICOTOXINAS DEPENDE DE FATORES EXTRÍNSECOS E INTRÍNSECOS Extrínsecos Intrínsecos Estação do ano; Condições de cultivo e colheita; Armazenagem; Região e Clima. Produto vegetal; Microbiota natural e contaminante; Umidade relativa e atividade de água; Temperatura; Infestação por insetos; % de integridade dos grãos.

FUNGOS TOXÍGENOS Aspergillus Fusarium Penicillium

Principais micotoxinas com seus respectivos fungos produtores, substratos e efeitos no homem e nos animais. Principais substratos Principais fungos produtores Principal toxina Efeitos Amendoim, milho Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus Aflatoxina B 1 Hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogênica. Trigo, aveia, cevada, milho e arroz Penicillium citrinum Citrinina Nefrotóxica para suínos Centeio e grãos em geral Claviceps purpurea Ergotamina Gangrena de extremidades ou convulsões Milho Fusarium verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago Cevada, café, vinho Aspergillus ochraceus e Aspergillus carbonarius Ocratoxina Hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogênica. Frutas e sucos de frutas Penicillium expansum e Penicillium griseofulvum Patulina Toxicidade vagamente estabelecida Tricotecenos Hemorragias, vômitos, dermatites Zearalenona Baixa toxicidade; síndrome de masculinização e feminização em suínos Milho, cevada, aveia, Fusarium sp; Trichothecium trigo, centeio sp Cereais Fusarium graminearum

PRINCIPAIS MICOTOXINAS AFLATOXINAS B 1 e B 2 = Fluorescência azul (Blue em UV); G 1 e G 2= Fluorescência verde (Green em UV); M= (leite- milk) OCRATOXINA ZEARALENONA FUMONISINAS TRICOTECENOS: DEOXINIVALENOL (DON), T-2, HT-2, NIVALENOL PATULINA

AFLATOXINAS B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 e M 2; são furocumarinas complexas com intensa fluorescência sob luz ultravioleta; B – fluorescência azul G – fluorescência verde são substâncias cristalinas, apolares (metanol, clorofórmio, tolueno); altamente estáveis na ausência de luz UV e a temperaturas acima de 100ºC (TERMOESTÁVEIS)

ESPÉCIES PRODUTORAS Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Temperatura crescimento: 12 -42ºC, com ótima a 32ºC; Aw mínimo 0, 80 a 37ºC; Países tropicais e subtropicais.

AFLATOXINAS Aflatoxina B 1 Substância hepatocarcinogênica, mutagênica Pertencente ao Grupo 1: carcinogênico para humanos (IARC/1993) Aflatoxina M 1 Quando o gado leiteiro é alimentado com ração contaminada com AFB 1, parte desta toxina pode ser convertida em um derivado hidroxilado, que pode ser secretada no leite Presente no leite e produtos derivados Grupo 2 B: agente possivelmente carcinogênico (IARC, 1993)

DADOS DA INCIDÊNCIA DE AFLATOXINAS EM DIFERENTES ALIMENTOS INGERIDOS PELA POPULAÇÃO BRASILEIRA (RODRIGUEZAMAYA &SABINO, 2002).

TOXICOCINÉTICA Substâncias lipossolúveis, absorvidas no duodeno por difusão passiva Micotoxina Trato gastrointestinal Fezes Sistema porta-hepático Fígado Leite, ovos Sistema circulatório do sangue Rim Urina Bile Músculo

METABOLISMO

Wild C , Turner P Mutagenesis 2002; 17: 471 -481

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS DAS AFLATOXINAS Micotoxinas estão, em geral, presentes em concentrações muito baixas (ppb), que passam desapercebidas por quem ingere o alimentos, em virtude de não alterarem suas propriedades organolépticas. Entretanto, em países com escassez de alimentos e nos quais a população passa fome, a qualidade do alimento é a última coisa a se considerar. Nestes países, a prevalência de efeitos tóxicos agudos (micotoxicoses), ou crônicos (carcinoma hepático) é mais elevada.

AFLATOXICOSES – INTOXICAÇÕES AGUDAS Alterações hepáticas 1, 0 ppm Hemorragias na musculatura Aflatoxicose aguda

AFLATOXICOSES – INTOXICAÇÕES AGUDAS Sintomas após ingestão, durante 3 semanas, de arroz contaminado com aflatoxinas com concentrações de 200 mg/Kg: • Edema de membros inferiores; • Dores abdominais; Já foi relatado um • Vômitos; caso letal de uma • Hepatomegalia; criança de 3 anos, • Necrose hepática; envolvida com a • Esteatose; ingestão de arroz • Hipoglicemia; mofado contendo 10 • Hiperamonemia; mg de aflatoxinas/Kg • Convulsões. de alimento.

AFLATOXINAS EM RAÇÕES AVES: � Inibição do crescimento; � Inibição dos mecanismos de resistência imunológica; � diminuição da produção de ovos; � sensibilidade a machucaduras. BOVINOS: � Alterações reprodutivas (redução); � redução de peso; � redução da produção leiteira; � contaminação do leite (Afla M 1) SUÍNOS: � Alterações reprodutivas (infertilidade e abortos); � redução do crescimento;

CARCINOGENICIDADE DAS AFLATOXINAS É através da alta frequência de ingestão de alimentos contaminados com baixos teores de micotoxinas (ng/g ou ppb), que reside o maior risco para a população exposta; Existe relação causal entre ingestão de aflatoxina e câncer hepático. Dois tipos de interações com ácidos nucléicos podem ocorrer: ligação nãocovalente, reversível, e formação de ligação covalente, irreversível, necessitando de ativação metabólica. O composto tóxico é o derivado 8, 9 epóxido.

O 8, 9 -epóxido da Aflatoxina B 1 forma um aduto com a guanina no DNA

Este produto (aduto) leva a uma quebra da ligação entre a base e o açúcar, resultando em um sítio apurínico. Normalmente, adeninas são introduzidas em sítios apurínicos, levando a uma mutação no DNA. G: C → 0: A → T: A Ou seja, a ligação do metabólito tóxico da Aflatoxina ao DNA leva a uma transversão G: C → T: A, causando uma mutação no DNA. É esta mutação que ocasiona o câncer.

RESOLUÇÃO RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO 2011 (PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO D IÁRIO OFICIAL DA UNIÃO Nº 37, PAGINA 72 -73)

OCRATOXINA Amidas da L-ß fenilalanina com isocumarinas; Composto incolor e cristalino; Solúvel em solventes orgânicos polares e ligeiramente solúveis em água.

PRINCIPAIS FUNGOS PRODUTORES - OCRATOXINA Penicillium verrucosum - Países de clima temperado - T ótima = 20ºC - aw mínimo = 0, 80 - comum em cereais, queijo, cerveja Aspergillus ochraceus - T ótima = 24 - 31ºC - aw min = 0, 77 a 25ºC - Alimentos de Aw (grãos, cereais, milho, soja)

PRINCIPAIS FUNGOS PRODUTORES - OCRATOXINA Aspergillus carbonarius - T ótima = 32 – 35ºC; - Frutas secas, uva, vinho, café; - Nefrotóxica e nefrocarcinogênica; - Nefropatia endêmica dos Balcãs.

OCRATOXINA NO CAFÉ Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum – Algumas populações européias registram alta incidência de nefropatias decorrentes da ingestão da ocratoxina A. Quantidade de ocratoxina que ingerimos é diminuída pois: • O café não é consumido em grãos; • Torração elimina 90% da toxina; • Filtragem do pó retém parte da toxina.

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS - OCRATOXINA Lipossolúvel, comporta-se como eletrólito fraco, sendo mais absorvida no estômago e duodeno. Sofre efeito de primeira passagem (fígado) Os rins são os órgãos onde a Ocratoxina mais se distribui Excreção renal da forma biotransformada e fecal É nefrotóxica e nefrocarcinogênica Parece estar associada com a nefropatia endêmica dos Balcãs – observada nas zonas rurais da Bulgária, Romênia e Ioguslávia. Índices de toxicidade: Ingestão Semanal Aceitável provisória= 0, 1 µg/Kg peso corporal

RESOLUÇÃO RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO 2011 (PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO D IÁRIO OFICIAL DA UNIÃO Nº 37, PAGINA 72 -73)

Aplicação imediata Limite máximo tolerado (ppb)

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

FUMONISINAS FB 1, FB 2 e FB 3 São poliálcoois, esterificados com ácido carboxílico 1, 2, 3; Baixa lipossolubilidade; Fungos produtores: - Fusarium verticillioides; - Fusarium proliferatum - Contaminantes do milho, principalmente

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS - FUMONISINAS Milho contaminado com fumonisinas destinados à alimentação humana tem sido associado com uma alta incidência de câncer de esôfago em populações do Sul da África, podendo também exercer importante promoção de câncer hepático em algumas regiões da China. Classe 2 B – carcinogênicas substâncias potencialmente

FUMONISINAS- LEUCOENCEFALOMALACIA (LEME)

LEUCOENCEFALOMALACIA (LEME) Esta afecção é caracterizada por necrose da substância branca de um ou dos dois hemisférios cerebrais. De aparecimento súbito, cursa com anorexia, depressão, andar em círculos, tonteira , comprometimento da visão, hiperexcitabilidade, decúbito e morte após poucas horas ou até 48 horas do início dos sintomas, sendo esta uma característica comum da LEM A leucoencefalomalácia ( L E M ), doença neurotóxica fatal que acomete eqüinos, é causada pela ingestão de alimentos mofados.

RESOLUÇÃO RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO 2011 (PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO DIÁRIO OFICIAL DA UNIÃO Nº 37, PAGINA 72 -73) Aplicação imediata Limite máximo tolerado (ppb)

ZEARALENONA Intermediário da síntese de hormônios e promotores de crescimento; Patógeno de plantas; T ótima = 24 -26ºC; Aw mín = 0, 90; Fungos produtores: Fusarium graminearum.

OCORRÊNCIA Principalmente milho Cevada, aveia, sorgo, trigo, arroz. AÇÃO BIOLÓGICA Está relacionada com a capacidade de competir com o receptor do estradiol – hormônio sexual MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS Estrogenismo em fêmeas: inchaço e avermelhamento da vulva; inflamação uterina; aumento da secreção vaginal. , atrofia dos ovários, atrofia dos testículos – infertilidade. Pode causar o crescimento e lactação das glândulas mamárias em machos e em fêmeas.

TRICOTECENOS Produzidos por espécies do gênero Fusarium Compreendem mais de 170 compostos: Desoxinivalenol Encontrados em: arroz, trigo, aveia, centeio, sorgo, amendoim, feno, produtos processados tipo “corn flakes”

AÇÃO BIOLÓGICA Tricotecenos são substâncias com potente ação irritativa local: 1. Inibem a peptidiltransferase (síntese protéica); inibem a produção de energia, o que afeta funcionamento das membranas celulares; 2. Atuam sobre as aminas biogênicas no cérebro MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS Irritação local da pele e mucosas; Alterações neurológicas (recusa da alimentação e desorientação do vôo em aves) Hemorragia Aplasia medular (destruição da medula óssea) Imunossupressão

Tricotecenos: Armas biológicas? ? Em setembro de 1981, a Secretaria de Estado norte-americana declarou publicamente ter evidências do uso militar de potentes micotoxinas no Sudeste Asiático. Segundo o Departamento de Estado, a vegetação do Campuchéa estava contaminada, ao nível de ppm, por três micotoxinas do grupo dos tricotecenos, substâncias produzidas por fungos do gênero Fusarium. Os EUA alegaram, na ocasião, que se tratava de agressão química por parte da União Soviética. Este episódio ficou conhecido como o da Chuva Amarela (Yellow Rain). Uma grande controvérsia se estabeleceu entre cientistas norte-americanos e canadenses, com acirrada polêmica sobre a possibilidade de se tratar de uso militar de toxinas ou de ocorrência de tricotecenos ligada a algum evento natural. Para complicar, logo se evidenciaram discrepâncias entre a história governamental e os fatos experimentais. Um laboratório do Exército constatou 20 casos positivos em 60 amostras de sangue, urina e tecidos. Porém, suspeitou-se que as toxinas encontradas resultassem da ingestão recente de alimentos mofados. Finalmente, foi proposto que as contaminações provinham de fezes de abelhas (que defecavam durante o vôo) na forma de "densas misturas com pólen e outros materiais” Fonte: http: //www. nossofuturoroubado. com. br/arquivos/abril_09/bbs_de_quimica. html

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

PATULINA Produzida por diversas espécies de Aspergillus, Penicillium e Byssochlamys Principal espécie: Penicillium expansum – contaminante de maçã e outras frutas Solúvel em água O fungo pode ser encontrado na parte íntegra do fruto, mas para que se desenvolva e produza a micotoxina, é necessário que o fruto esteja danificado por danos físicos ou ataque de microrganismos ou larvas e insetos.

PATULINA Os fungos produtores de patulina dificilmente são destruídos pelo aumento da temperatura, pois formam ascósporos. Assim células sobreviventes podem produzir a micotoxina no produto final, ou seja, no suco de maçã. Para prevenir contaminação por patulina: Utilizar frutos de boa qualidade Aplicar nos frutos anidrido sulfuroso – inativa patulina Pasteurização remove até 4% Despectinização – até 1, 6% Concentração – até 18% ü ü ü

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS - PATULINA Intoxicações agudas: ü Edema pulmonar ü Processos hemorrágicos ü Danos capilares hepáticos, do baço e dos rins ü Edema cerebral o Possui provável atividade carcinogênica

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

Níveis de toxinas em alimentos e grãos permitidos em diferentes países País/Produto Micotoxina Limite – ppb ou µg/kg B 1 0 B 1 B 2 G 1 G 2 5 20 Farelo de soja B 1 30 Leite in natura e em pó M 1 0, 05 Produtos lácteos M 1 0, 5 Alimentos infantis B 1 B 2 G 1 G 2 3 Leite e derivados M 1 0, 5 B 1 B 2 G 1 G 2 30 zearalenona 200 ocratoxina 50 B 1 B 2 G 1 G 2 4 Argentina Alimentos infantis Amendoim, milho e derivados Uruguai Amendoim, soja e frutas secas Milho e cevada Arroz, cevada, café e milho CE- Comunidade Européia Cereais em geral, frutas secas, condimentos

Níveis de toxinas em alimentos e grãos permitidos em diferentes países País/Produto Micotoxina Limite – ppb ou µg/kg B 1 B 2 G 1 G 2 zearalenona 20 2 B 1 B 2 G 1 G 2 200 M 1 0, 5 Milho B 1 B 2 G 1 G 2 20 Farelo de milho B 1 B 2 G 1 G 2 20 Amendoim e subprodutos B 1 B 2 G 1 G 2 20 Leite fluido, amendoim e milho M 1 0, 5 Leite em pó M 1 5 Alimentos para consumo humano (somatório das 4 aflatoxinas) B 1 B 2 G 1 G 2 20 Matérias primas e rações- (Portaria MA/SNAD/SFA 07 de 09/11/88). B 1 B 2 G 1 G 2 50 Estados Unidos Rações de crescimento - aves e suínos Ração final – suínos Produtos lácteos MERCOSUL BRASIL (Res. RDC 274, 2002) Fonte: FONSECA ( Micotoxinas), BAKKER-ARKEMA(1999); CIB, 2004.

Como eliminar a micotoxina do alimento? • A melhor maneira de se controlar a presença de micotoxinas em alimentos é evitar sua formação – controlar crescimento fungos 1. q q q Processos físicos: Limpeza de grãos (remocão de fumonisinas em milho) Temperaturas acima de 150 -220º C Microondas em alta potência 2. Processos químicos q Ácidos, bases, peróxido de hidrogênio, bissulfito de sódio – descontaminação química de rações q Figos secos têm sido descontaminados com bissulfito de sódio e com peróxido de hidrogênio – destrói aflatoxinas e desoxivalenol

Como eliminar a micotoxina do alimento? 3. Processos biológicos: q Destruição de aflatoxinas por microrganismos como Flavobacterium aurantiacum e cepas não produtoras de Aspergillus flavus. 4. q q q Processamento dos alimentos Refinação de óleos (↓ aflatoxina) Torrefação do café (↓ ocratoxina) Filtração do pó do café (↓ ocratoxina) Concentração do suco de maçã (↓ patulina) Moagem de milho em meio úmido (↓ zearalenona, aflatoxinas e fumonisinas em amido) q Produção da cerveja (a ocratoxina no malte é totalmente destruída)

Controle Biológico Uma cepa competitiva de A. flavus que não produz aflatoxina é aplicada nas plantações de amendoim. Esta cepa se prolifera e compete com a cepa produtora de aflatoxinas, diminuindo a quantidade desta última.

PROBLEMA: Fungo Aspergillus se beneficia do ataque de insetos e libera micotoxinas SOLUÇÃO: Já existe um milho geneticamente modificado que contém um gene da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), o qual faz a planta produzir uma proteína tóxica para determinados insetos, reduzindo os ataques em até 90%.

MICOTOXINAS Métodos de Análises

MÉTODO IDEAL Um método ideal – eficiente e adequado – para análise de micotoxinas deve ser simples, rápido, preciso, barato, automatizado, sensível e seletivo. A seqüência analítica básica para a maioria dos métodos químicos usados em análise de micotoxinas é: (a) preparo das amostras; (b) extração; (c) limpeza; (d) detecção e quantificação e (e) confirmação.

ETAPAS DA PESQUISA DE MICOTOXINAS EM ALIMENTOS A. Preparo da amostra; B. Extração; C. Limpeza: remoção de interferentes; D. Detecção e quantificação; E. Confirmação.

A. PREPARO DE AMOSTRA A coleta da amostra e seu preparo é o passo mais importante no procedimento de análise das micotoxinas. Ela deve ser representativa do lote a ser analisado. Instruções básicas na coleta de amostras para a detecção da presença de micotoxinas: publicadas pela AOAC – Association of Official Analytical Chemists; Acondicionamento: amostras devem ser acondicionadas de modo que se evite a produção de toxinas após a coleta; Para a análise, a sub-amostra é removida da amostra triturada, e a aflatoxina é extraída e quantificada.

A. PREPARO DE AMOSTRA A amostragem é, indubitavelmente, o fator mais importante para a variação verificada nas análises de aflatoxinas em produtos agrícolas em grãos. Este fato é devido à distribuição extremamente desuniforme das aflatoxinas nos produtos agrícolas não processados; Devido à heterogeneidade, os alimentos foram classificados de acordo com a possível distribuição das toxinas: - Tipo I – Alimento onde é esperado alto grau de heterogeneidade de contaminação: grãos, sementes, nozes, frutas secas, grãos grosseiramente triturados; - Tipo II – Alimento onde é esperado exibir contaminação homogênea: líquidos e pó; - Tipo III – Alimento que exibe heterogeneidade intermediária: farinhas, pastas, tortas de oleaginosas e cereais secos (SCUSSEL, 1998).

B. EXTRAÇÃO Solventes usados: clorofórmio, acetona, metanol, acetonitrila, benzeno, acetato de etila, hexano e água; Muitas micotoxinas são solúveis em solventes orgânicos, mas pouco solúveis em água. A extração é freqüentemente aumentada pela água, que no caso de cereais, por exemplo, “dilata e amolece” as células, facilitando a penetração e a extração pelos solventes orgânicos. Para extração de lipídeos: hexano; Técnicas físicas empregadas: agitação em alta velocidade durantes alguns minutos ou agitação vigorosa por no mínimo 30 min; Filtração: para remover a parte sólida.

C. LIMPEZA: REMOÇÃO DE INTERFERENTES As técnicas mais comuns de limpeza são extração de gordura, cromatografia de coluna, precipitação e partição líquido-líquido; Após a limpeza, concentrar: através de um banho de água sob pressão reduzida em um evaporador rotatório, ou utilizar um banho de água sob nitrogênio, banho-maria (temperatura sempre inferior a 50ºC).

D. DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO Maioria utiliza a CCD para quantificar: sensível e de baixo custo, várias amostras simultaneamente. A quantificação na CCD é feita através de comparação visual da intensidade de fluorescência da amostra com a do padrão. E. CONFIRMAÇÃO O tratamento da cromatoplaca com vários reagentes é largamente usado para identificação de micotoxinas, por exemplo: ao vaporizar a cromatoplaca com H 2 SO 4 50% ou ácido trifluoroacético (TFA) para as amostras positivas, as manchas apresentando cores características para aflatoxinas mudam para amarelo. Se negativo, as cores não mudam de cor.

OUTROS MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICOTOXINAS continuação

DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO 1. 2. Técnicas físico químicas: CCD (Cromatografia em camada delgada); CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência); Técnicas biológicas: imunoensaios Radioimunoensaio (RIA)*- utiliza isótopos radioativos; Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)*; *baseadas na competição de ligação entre toxina não marcada proveniente da amostra e a toxina marcada sobre locais específicos do anticorpo 1. imunoafinidade que é uma técnica cromatográfica baseada diretamente na ligação antígeno com anticorpo fixado numa coluna de cromatografia).

CROMATOGRAFIA TÉCNICA UTILIZADA PARA SEPARAÇÃO DE MISTURAS COMPLEXAS DE SUBST NCIAS. Solvente fluindo continuamente a partir de um reservatório Amostra aplicada Eluição e separação do componente 1 INICIALMENTE UTILIZADA PARA SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS COLORIDOS (CROMO: COR E GRAFIA: PINTURA) Eluição e separação do componente 2

CROMATOGRAFIA O método baseia-se na migração diferencial das substâncias em um sistema cromatográfico, constituído pela mistura a ser separada, pela fase móvel e pela fase estacionária. Componentes de uma cromatografia 1. Mistura a ser separada (substâncias orgânicas com diferentes solubilidades, afinidades etc) 2. Fase estacionária: constituído por um sólido ou um líquido 3. Fase móvel: constituída por um ou mais solventes ou por gases.

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO – Camada Delgada (CCD) Características: -Fase estacionária: sólido polar finamente dividido como sílica (Si. O 2 x H 2 O), alumina (Al 2 O 3). - Fase móvel: Solventes orgânicos ou mistura de solventes com polaridades variadas, dependendo do que se deseja separar. Normalmente utiliza-se solventes apolares. Princípio: As substâncias polares adsorvem-se na fase estacionária polar, ficando mais fortemente retidas. Ao se passar um solvente apolar, este carregará primeiramente as substâncias apolares (migrarão primeiro).

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO – Camada Delgada (CCD) Cromatografia analítica: para pequenas quantidades de material. Placa Topo da placa Início Final Solvente

CCD – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CCD – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) Princípio: • Coluna contendo fase estacionária finamente dividida. Pode ser um sólido (cromatografia por adsorção) ou um líquido com alto ponto de ebulição empacotado. Material muito utilizado: octadecil sulfato – fase reversa. • Como fase móvel podem ser utilizados tampões aquosos ou solventes orgânicos. • Ocorre aplicação de uma alta pressão na entrada da coluna, fazendo com que o material seja separado muito rapidamente. • Este sistema permite alta perfomance e reprodutibilidade (condições constantes e padronizadas).

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) Injetor Bomba Coluna Reservatório Detectores de Ultra violeta, luz visível e índice de refração.

DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® CELL CLAE- mais sensível e mais rápida, só que o custo do equipamento é alto; Método (CLAE) utilizando coluna de imunoafinidade (AFLAPREP®) para clean-up das amostras e derivatização pós-coluna para AFB 1 e AFB 2 com célula eletroquímica KOBRA® Cell : - componente principal do AFLAPREP® é a coluna de imunoafinidade, contendo no gel uma suspensão de anticorpo monoclonal fixado em suporte sólido. O extrato da amostra é passado por esta coluna. Se alguma aflatoxina estiver contida na amostra irá ser retida pelo anticorpo suspenso no gel. A toxina ligada ao anticorpo é eluída da coluna com metanol ou acetonitrila. O eluato é analisado via CLAE.

DETECÇÃO: CROMATOGRAFIA DE IMUNOAFINIDADE (IAC)

DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® CELL É necessário que se faça a derivatização das AFB 1 e AFG 1 a fim de realçar sua fluorescência sob a luz UV e fazê-las detectáveis mais facilmente. A KOBRA®Cell (R-BIOPHARM RHÔNE LTD, 2004) é uma célula eletroquímica que gera o agente de derivatização, bromo, do brometo de potássio presente na fase móvel.

DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® CELL Cromatograma de pool de padrões sem KOBRA® Cell Cromatograma de pool de padrões com KOBRA® Cell

DETECÇÃO: IMUNOENSAIO ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOABSORBENT ASSAY) Baseia-se na interação entre antígeno (aflatoxina) e anticorpo. Para resultados mais precisos, com instrumentos de leitura como um espectrofotômetro ou uma leitora de microplacas por absorbância, pode-se obter até mesmo a concentração. Este já é chamado de ELISA QUANTITATIVO. Normalmente, para isto, deve-se possuir padrões, com valores de concentração conhecidos. A partir destes padrões, pode-se traçar uma curva de calibração.