Formation laborantin en analyse mdicale Module biochimie mdicale

Formation laborantin en analyse médicale Module : biochimie médicale Exploration de la fonction hépatique Présenté par Dr. DOUKHI

I- Introduction : Le foie est un organe essentiel, aux rôles multiples. Son bon fonctionnement est indispensable à la vie. La multiplicité et la complexité des fonctions du foie rendent ses méthodes d’exploration nombreuses qui doivent pour être valables porter sur l’ensemble des fonctions du fait de l’asynergie fonctionnelle du parenchyme hépatique. L'exploration biologique hépatique correspond aux tests sanguins qui permettent d'évaluer la qualité fonctionnelle du foie (bilan fonctionnel hépatique).

Rappel anatomo-histologique le foie est l’organe le plus volumineux du corps humain, ayant un poids de 02 Kg. le foie est situé dans la loge sous phrénique droite, formé de 02 lobes: -Droit : volumineux -Gauche : plus petit

Vascularisation et innervation du foie

1. HEPATOCYTES: 75 ٪ -Cellulesnucléés et volumineuses , riches en glycogène et en lipides. Leur fonction se résume à l’épuration, siège de nombreuses voies métaboliques. L’hépatocyte possède un pole vasculaireen rapport avec les capillaires sinusoïdes, et un pole biliaire en rapport avec les canalicules biliaires(s/f de microvillosités) 2. CELLULES DES SINUSOIDES: 25 ٪ -Cellules de kupffer(défense): macrophages tissulaires -Cellules endothéliales (barrière séparant les hépatocytes du flux sanguin): jouent un rôle actif dans le transport de certaines substances (HDL modifiées, glycoprotéines); -Cellules Ito: impliquées dans le stockage de vitamine A.

II- Fonctions du foie : 1 - Fonction biliaire : Par l’intermédiaire de la sécrétion biliaire, le foie assure l’élimination de métabolites endogènes et exogènes, potentiellement toxiques pour l’organisme, et la sécrétion des acides biliaires nécessaires à l’absorption digestive des graisses. La bile est sécrétée par les hépatocytes et stockée dans la vésicule biliaire. L’excrétion de la bile se fait en post-prandiale. L’absence de bile entraîne une insolubilisation des lipides qui perturbe la fonction des micelles, ce qui entraîne un déficit en vitamines liposoluble (A, D, E, et K) et en cholestérol alimentaire, ce qui traduit la stéatorrhée au cours de la cholestase avec le déficit en vitamines en particulier vitamine K, responsable d’anémie et de trouble hémorragique.

Formation de la bilirubine : Elle provient en majeure partie (80 à 95%) de la destruction dans le système réticuloendothélial des hématies vieillies. Hème → bilirubine non conjuguée → circule dans le sang associée à l’albumine jusqu’au foie → glucuronoconjugaison hépatique → bilirubine conjuguée → passage dans la bile qui sera excrétée dans l’intestin

2 - Fonction métabolique : • Métabolisme glucidique (Maintien de la glycémie) - Néoglucogénèse, Glycogènogénèse, Glycogénolyse. • Métabolisme lipidique - Synthèse des AG, TG, PL, cholestérol. - Formation de lipoprotéines • Métabolisme protéique - Uréogénese - Synthèse de l’albumine, des protéines, facteurs de coagulation…

3 - Fonction de détoxification : • Les médicaments, le plus souvent liposolubles, sont transformés dans les hépatocytes, souvent par le système enzymatique des cyto. P 450. • Les médicaments métabolisés ou leur métabolite intermédiaire, peuvent être à l'origine de lésions hépatiques.

III- Exploration hépatique : Il existe 5 groupes de tests selon la classification de FAUVERT La sélection d’un groupe de tests permet l’analyse d’une fonction hépatique donnée - Test de rétention biliaire - Test de cytolyse hépatique - Test d’épuration plasmatique et de détoxication - Test d’activité métabolique - Test de la réaction inflammatoire Auxquels on rajoute des examens complémentaires suivant les exigences diagnostic

III. 1. Test de rétention biliaire : Cholestase Définition de la cholestase : • Ensemble des manifestations liées à la diminution ou à l’arrêt de la production biliaire. • Elle résulte soit : – D’un désordre fonctionnel important entraînant une atteinte des cellules hépatiques (cholestase intrahépatique). – D’un obstacle mécanique à l’écoulement de la bile (cholestase extrahépatique). Caractérisation biochimique : ↗ bilirubine conjuguée ↗ Cholestérol total enzymes : ↗ PAL (2 N-4 N) ↗γGT (10 N-20 N) ↗ 5’ Nucléotidase

Dosage de la bilirubine : Prélèvement : Sérum ou plasma (héparinate de lithium). Précautions à prendre : - Protection des prélèvements à l’abri de la lumière (BRB photo-oxydable) - Examen d’urgence (néonatalogie) Méthode de mesure : Dosage colorimétrique après diazotation Principe : La réaction se fait en deux étapes : – Préparation du diazoréactif : Acide sulfanilique + nitrite de sodium → diazoréactif

Remarque : HPLC est la méthode de référence pour la détermination de la bilirubine. Valeurs usuelles : BRB totale < 17 μmoles / L (< 10 mg / L) BRB libre < 3 μmoles/L BRB conjuguée 4 à 13μmoles/L Pédiatrie : Seuil critique pour bilirubine nouveau-né < 10 jours: > 250 μmoles/ L

Variations pathologiques ↗ BRB libre : • Par destruction exagérée des hématies • Par déficit de la glucuronoconjugaison ↗ BRB conjuguée : • Maladies congénitales par défaut d’excrétion • Cholestases intra et extra-hépatiques

Enzymes : PAL (Phosphatase alcaline) : (EC 3. 3. 1. ) C’est une metallo-glycoproteine à zinc qui catalyse à p. H alcalin l’hydrolyse d’un grand nombre d’esters monophosphoriques en libérant un ion phosphate et suivant l’ester utilisé, un alcool, un phénol ou un ose. Localisation tissulaire : FOIE, OS, Rein, Muqueuse intestinale, PAL Placentaire.

Prélèvement: le sérum ou le plasma ou bien échantillon d'urine, leucocytes, LCR, liquide amniotique. . . Éviter les anticoagulants, surtout l'EDTA, le citrate, le fluorure, l'oxalate, qui piègent le Mg 2+ et entraînent une diminution d'activité. Rejeter les prélèvements hémolysés. La stabilité de la PAL est assurée dans le plasma ou le sérum pendant 48 heures à+4 °C, plusieurs mois à - 20 °C.

• Principe général : en présence de tampon et de Mg 2+, la PAL hydrolyse le PNPP avec formation de PNP, d’ortophosphate d’AMP phosphate (IFCC) ou de DEA phosphate (DGKC). • L’activité de la PAL est déterminée en mesurant la vitesse d’apparition du PNP à 405 nm

↗chez l’enfant en période de croissance ↗ Au 3ème trimestre de Grossesse

Variations pathologiques ↗ Dans les affections hépato-biliaires : cholestase, hépatite, cancer Mais aussi : – ↗chez l’enfant en période de croissance – ↗ Au 3ème trimestre de Grossesse – ↗dans les affections osseuses.

les isoenzymes de la PAL. Il existe au moins 4 isoenzymes de la PAL, codés par des gènes distincts. - Les 3 premiers gènes sont localisés sur des régions contiguës du chromosome 2. Ils codent respectivement pour les PAL: - placentaire - intestinale - des cellules germinales. - Le 4ème gène est localisé sur le chromosome 1. On l'appelle le gène des tissus non spécifiques, en raison de la diversité des tissus où il s'exprime. Ex: dans le foie, la phosphatase hépatique Dans l'os, la phosphatase osseuse.

Gamma glutamyl transférase (γGT) : (EC 2. 3. 2. 2) La γGT catalyse le transfert d’un groupement γ-glutamyl d’un peptide ou d’une substance qui le renferme à un acide aminé ou à un autre peptide. Sa demi-vie est comprise entre 14 et 26 jours La y- glutamyltranspeptidase sert au transport membranaire du radical glutamyl mais aussi d'autres aminoacides.

Principales localisations de la GGT dans les tissus humains normaux Organe Rein Poumon Foie Pancréas Intestin Rate Endomètre Prostate Localisation Tubules proximaux Macrophages alvéolaires Canaux et canalicules biliaires Canaux et cellules acineuses Épithelium et cryptes Artérioles (tissu conjonctif) Épithelium prolifératif Épithelium et sécrétions

Détermination de l’activité enzymatique : • Prélèvement : Tube sec ou hépariné • Méthode colorimétrique : Vitesse de formation de la 4 -nitraniline (jaune) proportionnelle à l’activité de la g-GT Mesure de l’↗d’absorbance à 405 nm

Valeurs normales 37°C : • ≤ 61 UI/L chez l’homme • ≤ 36 UI/L chez la femme Variations pathologiques ↗Toutes affections hépatiques • dans la cholestase, les hépatites et les métastases hépatiques • ↗ Ethylisme, normalisation rapide après sevrage • ↗ Induction enzymatique (Medts : antiépileptiques…) • ↗ Affections pancréatiques

5’ Nucléotidase : (EC 3. 1. 3. 5) Est une phosphomonoestérase qui hydrolyse spécifiquement les nucléotides dont le phosphate est attaché en position 5 du pentose. Méthode de dosage : par détermination du phosphate ou dosage de l’adénosine. Non demandées en routine car ne rapportent pas plus de renseignement que la PAL Valeurs normales : < 9 UI/L Spécifique des affections hépatiques : –↗Cholestase intra ou extra-hépatique = Marqueur Sensible et Spécifique Augmente également au cours des hépatites virales aigues, les cancers du foie et même dans certains cas de cirrhose ou d’hépatites alcooliques.

III. 2. Test de cytolyse hépatique : Définition de la cytolyse hépatique : C’est une souffrance cellulaire entrainant la destruction des cellules hépatiques avec libération de leur contenu au niveau plasmatique. Caractéristiques biochimiques : ↗Transaminases ↗LDH ↗OCT

Aminotransférases: L-aspartate aminotransférase (ASAT=TGO) : Localisation tissulaire : COEUR, Foie, rein, muscle Localisation cellulaire : – Dans le cytoplasme (20%) – Dans la matrice mitochondriale (80%) L’activité de la TGO nécessite la présence d’un cofacteur le phosphate de pyridoxal

Variations pathologiques ↗ Affections hépatiques (ALAT > ASAT sauf Hépatite éthylique ASAT>ALAT) ↗ des ASAT dans les atteintes cardiaques (Infarctus du myocarde)

Aminotrnsférases : ALanine Amino Transférase (ALAT=TGP) : Localisation tissulaire : FOIE, Coeur, rein Localisation cellulaire : 100% Cytoplasmique Activité biologique : Utilise le phosphate de pyridoxal comme cofacteur Variations physiologiques : ↗chez le Nné, normalisation en 6 mois Variations pathologiques : = Marqueur le + discriminant de la cytolyse hépatique (ALAT > ASAT)

Méthode de dosage : Prélèvement : – Tube sec ou hépariné. – Eviter l’hémolyse. Techniques spectrophotométriques dans l’UV : – Mesure de la disparition du NADHH+ à 340 nm par spectroscopie UV

Lactate deshydrogénase (LDH) : EC 1. 1. 1. 27 Enzyme cytoplasmique, la lactate déshydrogénase (LDH) est présente dans tous les tissus de l'organisme humain, les cellules sanguines nucléées, les érythrocytes et les plaquettes. La LDH catalyse l'oxydation réversible du L-lactate en pyruvate, en présence de NAD+ comme accepteur d'hydrogène. Dernière étape de la glycolyse en anaérobiose, elle permet de produire de l'ATP et du NAD+. En aérobiose, le pyruvate formé est utilisé dans la néoglucogenèse pour régénérer de l'ATP et du NADH 2. Son élévation sérique est le signe sensible et précoce d'une lésion tissulaire, même modérée et cliniquement silencieuse.

Méthode de dosage : L’activité de la LDH est déterminée par spectrophotométrie basée sur l’absorption du NADH, H+

Valeurs normales : 210 à 420 UI/L Variations pathologiques : = Enzyme de cytolyse, peu spécifique – ↗ Affections hépatiques. – ↗ Affections cardiaques (Infarctus du myocarde) – ↗ Anémies hémolytiques

Les isoenzymes de la LDH : Par électrophorèse sur acétate de cellulose, la LDH (tétramère de masse relative 145 k. Da) peut être séparée en 5 isoenzymes. chaque isoenzyme est constituée de l’association de deux types de sous-unités : M (pour muscle) et H(pour heart, cœur). M et H ont la même masse moléculaire, mais diffèrent par leur composition en acides aminés, leur réactivité immunologique, leur résistance à la chaleur et leur migration électrophorétique.

Ornithine carbamyltransférase (OCT) : C’est une enzyme du cycle de l’urée. Sa répartition est principalement hépatique et sa localisation est essentiellement mitochondriale. Les valeurs habituelles dans les érum pour la méthode à 37°C basée sur la colorimétrie à la diacétylmonoxime sont comprises entre 0. 2 et 1. 2 U/L (3. 3à 20 nkat/l)

III. 3. Test d’épuration plasmatique et de détoxication :

III. 4. Test d’activité métabolique : Définition de l’insuffisance hépatocellulaire : C’est l’ensemble des manifestations liées à la diminution ou à l’arrêt des fonctions des hépatocytes. Les causes sont les hépatites aigües, les hépatites chroniques actives ou les cirrhoses. Caractéristiques biochimiques : ↘ Albumine ↘ Fibrinogène ↘ facteurs de coagulation (↓TP) ↗ammoniaque sanguin, ↓ urée

Albumine Synthétisée uniquement par le foie • ↘modérée dans maladie hépatique aiguë (1/2 vie longue : 20 j) • ↘dans maladie hépatique chronique grave • Non spécifique des maladies du foie • Préalbumine = marqueur + sensible car ½ vie + courte • Dosage par : colorimétrie, immunonéphélémétrie • Valeurs usuelles: 35 -50 g/L

TP taux de Prothrombine • Valeurs usuelles : 100% (11 à 16 s) par rapport à un plasma normal • Test de coagulation qui apprécie - F I (Fibrinogène) - F II (Prothrombine) - F V (Pro-accélérine) - F VII (Proconvertine) - F X (Stuart) • Diminutions TP : - IHC par défaut de synthèse des facteurs - Défaut de la vit. K ou malabsorption intestinale de Vit. K, fréquente chez les cirrhotiques

Facteur V Synthèse indépendante de la vitamine K diagnostic différentiel entre l’IHC et carence d’apport en vit K

L’ammoniac (NH 3) • Issu de la désamination des AA et des composés aminés est détoxifié grâce à l’uréogénèse hépatique. • Valeurs normales : 20 -60 μmol/L • Méthode de dosage : - Colorimétrique : Réaction de Berthelot - Dosage enzymatique (GDH) • Variations physiologiques : Nné (immaturité hépatique) • Variations pathologiques : augmentation - IHC sévère, hépatites graves, cirrhose, coma hépatique - Acidose - Déficit congénital en OTC.

III. 5. Test de la réaction inflammatoire : Le phénomène inflammatoire est extrêmement fréquent au niveau du foie ou des globulines particulière sont élaborées et passent dans la circulation pour mettre en évidence un état inflammatoire, on a recours : - Electrophorèse des protéines - Dosage des immunoglobulines (Ig. A, Ig. M, Ig. G) - Dosage des protéines de l’inflammation (orosomucoide, haptoglobine, frcations C 3 et C 4 du complément).

III. 6. Examens spécifiques complémentaires : Ag et Ac des hépatites virales. AFP, ACE (marqueurs tumoraux). FIBROTEST/ACTITEST Le FIBROTEST correspond à un index de fibrose qui combine le dosage dans le sang de 5 marqueurs indirects de fibrose, avec un ajustement selon l'âge et le sexe de la personne. – Alpha 2 macroglobuline – Haptoglobine – Apolipoprotéine A 1 – Bilirubine totale – γGT Dans l’ACTITEST ces 5 marqueurs sont associés au taux d'ALAT : pour estimer l’activité nécroticoinflammatoire dans les hépatites chroniques C et B.

IV- Pathologies hépatiques : Définition de l’ictère : • Symptôme qui se traduit cliniquement par la coloration jaune des muqueuses et des téguments • Ictère provoqué par la présence en excès dans le sang de bilirubine • Devant un ictère, il faut toujours connaître les valeurs réelles de la BC et de la BNC pour en préciser le mécanisme

Les hépatites Le terme hépatite désigne tout processus inflammatoire du foie. Les causes les plus fréquentes des hépatites aiguës sont les infections virales et les médicaments

Maladies cholestasiques chroniques :

Fibrose La fibrose hépatique est définie par l’existance d’un phénomène inflammatoire chronique, d’où production de collagène, glycoprotéines, protéoglycanesacide hyaluronique dans la matrice extra-cellulaire => ↗ au niveau sérique Principale complication des atteintes hépatiques chroniques, sa progression conduit à terme à la cirrhose.

Cirrhose • Affection diffuse d’évolution prolongée d’un processus de destruction structural hépatique • Atrophie du parenchyme → remplacement par un tissu fibreux avec nodules de régénération • Conséquences : HTP, ascite. • Évplution vers hépatocarcinome

CBP Asymptomatique pensant 5 à 10 ans • Destruction progressive des petites voies biliaires intrahépatiques • Origine auto-immune : Ac anti- mitochondries • 1 er signe : prurit • PAL et γGT ↗↗↗