Formation ATRF savoirs et savoirs faire en Biologie

Formation ATRF savoirs et savoirs –faire en Biologie moléculaire 05 décembre 2019 Matin: 9 h – 12 h Après midi-: 14 h – 17 h ( ou 13 h 30 – 16 h 30)

Savoirs - Prérequis Biologie moléculaire: une sous-discipline de la Biologie Le terme « biologie moléculaire » , utilisé la première fois en 1938 par Warren Weaver, désigne également l'ensemble des techniques de manipulation d'acides nucléiques (ADN, ARN), appelées aussi techniques de génie génétique.

Savoirs - Prérequis Les acides nucléiques: ADN et ARN Un individu possède des milliers de gènes L’ensemble des gènes constitue le génome d’un individu.

Savoirs - Prérequis Les acides nucléiques: ADN et ARN Les acides nucléiques sont des molécules chargées négativement 99% du génome humain est commun à tous les individus. 1% est variable d’un individu à l’autre. = chaque individu possède son propre génome = chaque individu est unique

Savoirs - Prérequis Les acides nucléiques: du gène à la protéine = mécanismes d’expression des gènes

Savoirs - Prérequis Du gène à la protéine: un exemple Individu ayant pour groupe sanguin : A Un allèle: un version d’un gène Un gène qui s’exprime = une protéine

Les applications technologiques Extraction/ purification Restriction enzymatique Amplification par PCR Séquençage Analyse de profil génétique Extraction et purification de gène cible … Électrophorèse

La place de la biologie moléculaire dans les programmes de lycée En classe de seconde: SVT: extrait du programme (réforme) Toutes les cellules d’un organisme sont issues d’une cellule unique à l’origine de cet organisme. Elles possèdent toutes initialement la même information génétique organisée en gènes constitués d’ADN (acide désoxyribonucléique). Cependant, les cellules spécialisées n’expriment qu’une partie de l’ADN. Notions fondamentales : cellule, matrice extracellulaire/paroi, tissu, organe ; organite, spécialisation cellulaire, ADN, double hélice, nucléotides (adénine, thymine, cytosine, guanine), complémentarité, gène, séquence. Objectifs : les élèves apprennent que les cellules spécialisées ont une fonction particulière dans l’organisme, en lien avec leur organisation et que la structure moléculaire de l’ADN lui permet de porter une information.

La place de la biologie moléculaire dans les programmes de lycée En classe de seconde: Option Biotechnologie (réforme)

La place de la biologie moléculaire dans les programmes de lycée En classe de première: Spécialité SVT: extrait du programme (réforme) Capacités - Concevoir et/ou réaliser une réaction de PCR (amplification en chaîne par polymérase) en déterminant la durée de chaque étape du cycle de PCR. Calculer le nombre de copies obtenues après chaque cycle. - Concevoir et réaliser un protocole pour étudier l'action d'un agent mutagène (par exemple les UV) sur la survie des cellules et sur l'apparition de mutants. - Mener une démarche historique ou une étude documentaire sur le séquençage des macromolécules (protéines, ARN et ADN).

Exemple d’une séquence à préparer Objectif de l’enseignant: mettre en œuvre une grande étape de la réalisation d’un profil génétique dans le cadre d’une enquête policière: l’électrophorèse (kit ADN suspect® sordalab) Objectif de l’agent de laboratoire: préparer le matériel et les produits nécessaires pour la réalisation de la séquence.

L’électrophorèse L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif).

L’électrophorèse Au laboratoire, une électrophorèse de fragments d'ADN sur gel d’agarose permet de séparer les molécules en fonction de leur taille. À p. H neutre, les molécules d’ADN sont chargées négativement. Elles migrent donc vers l'anode (pôle positif). Au fur et à mesure de leur migration dans le gel d'agarose, les molécules se séparent en fonction de leur taille. L'électrophorèse sur gel d'agarose peut servir, par exemple, à : identifier la taille de fragments d'ADN (par comparaison avec un marqueur de taille) ; donner une indication de la quantité d'ADN présente ; purifier un fragment particulier à partir du gel.

Principe de l’électrophorèse

Le gel d’agarose L'agarose est un polyoside extrait de l'agar, composé de la répétition d'un diholoside. Il est utilisé en biologie moléculaire pour des électrophorèses sur gel. L'agarose se présente sous la forme d'une poudre blanche qui se dissout dans l'eau en ébullition. Lorsque la température descend en dessous de 40 °C, la solution devient un gel. Plus la concentration d'agarose est élevée dans le gel, plus la taille des pores est petite.

Les différents degrés de maillage de gel d’agarose: Selon l’objectif de l’électrophorèse et le type de molécules séparées on choisit un % d’agarose adapté. = plus le % d’agarose est élevé plus le maillage est serré plus la résolution de séparation sera fine. Donc plus les fragments à séparer sont petits plus on augmente le % d’agarose Gel à 0, 8 % Gel à 1, 25 % Gel à 2 %

Le tampon de migration Il existe un nombre très varié de tampons. Les plus souvent utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB). Le TAE possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille. Le Tampon TBE (pour Tris, Borate, EDTA) est un tampon de migration utilisé en électrophorèse et composé de Tris, d'acide borique et d'EDTA. Contrairement à la notice technique on utilise plutôt du tampon TBE 0, 5 X

Exemple d’une séquence à préparer Matière d’œuvre demandée: Réactifs nécessaires pour la mise en œuvre du kit ADN suspect pour 6 élèves: - 3 gels d’agarose à 0, 8% avec 10 puits dont 1 gel avec les résultats de l’électrophorèse - 1 L de tampon TBE 0, 5 X (pour préparation de 3 gels et pour la migration électrophorétique) - les différents tubes d’ADN du kit - flacon d’Azur A - flacon d’éthanol Matériel: - 2 cuves d’électrophorèse avec générateur - 1 transilluminateur ou lampe - 1 centrifugeuse à microtube

Exemple d’une séquence à préparer Calculs préalables: 1 gel d’agarose = environ 50 m. L donc 3 gels = 150 m. L Gel à 0, 8% = 0, 8 g d’agarose pour 100 m. L de gel Donc pour préparer 150 m. L il faut: m(agarose) = ( 0, 8 x 150 ) / 100 = 1, 2 g Dissolution à réaliser en tampon TBE 1 X: prendre 170 m. L (rajouter 20 m. L pour prendre en compte l’évaporation lors du chauffage)

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Préparation des gels d’agarose à 0, 8% 3 - Faire chauffer au micro-onde ou sur plaque chauffante jusqu’à ce que la solution soit limpide (remuer régulièrement) 1 - Peser 1, 2 g d’agarose dans un grand bécher en verre (250 m. L ) 2 - Ajouter 170 m. L de tampon TBE 1 X 4 - attendre que le gel soit redescendu à température (55 -65°C) puis couler le gel dans le support de gel 5 - laisser solidifier le gel 6 - retirer délicatement le peigne et les butoirs

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Montage de la cuve à électrophorèse Déposer le support de gel dans la cuve Puits côté cathode (borne négative, côté noir) Remplir la cuve avec le tampon de migration de manière à ce que le gel soit immergé (puits remplis de tampon)

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Préparation des échantillons 1 1 1 tubes « ADN scène de crime tube suspect X 1 tube suspect X 2 tube suspect Y 1 tube suspect Y 2 Bleu de dépôt: alourdit l’ADN et permet la visualisation de la migration

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Dépôt des échantillons Volume de dépôt: 15 µL Ne pas faire de bulles d’air Ne pas déborder Ne pas percer le fond du puits Éviter les tremblements Tenir la micropipette à la verticale Mettre un fond noir sous la cuve pour mieux visualiser le dépôt Ne pas attendre trop longtemps pour démarrer l’électrophorèse

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Migration Fermer le couvercle de la cuve Relier la cuve au générateur par les cables Régler le générateur Réglage du générateur: Entre 70 V et 120 V 70 V = migration précise mais plus longue 120 V= migration moins précise mais plus rapide Laisser migrer jusqu’à environ 2 cm du bord opposé (coté anode)

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Révélation L’ADN n’étant pas naturellement visible on a recours à des colorants pour révéler les résultats. Option 1: les produits du kit sont déjà mélangé au révélateur (ex: Safegreen) Donc on peut observer directement avec le transilluminateur adapté. Option 2: il faut colorer le gel après migration. Après des opérations de rinçage le gel est décoloré mais pas les bandes d’ADN. Plusieurs colorants existent. On utilise souvent l’AZURE A (colorant bleu)

Les étapes de la préparation des gels et du gel « résultat » Révélation à l’azure A Colorant : solution alcoolique d'Azure A : 0. 04 g Éthanol à 20 % : 100 m. L L'Azur A est disponible chez SIGMA (référence A 6270, 1 g : 62. 00 FF HT) Coloration et décoloration Recouvrir la surface du gel avec le colorant. Laisser agir exactement 4 minutes puis vider le colorant (qui reste réutilisable). Éliminer l'excès de colorant de la surface avec quelques m. L d'alcool à 70 % ou d'alcool à brûler pendant quelques secondes. Éliminer l'alcool puis rincer à l'eau du robinet. Rincer plusieurs fois pour éliminer totalement le colorant. On voit apparaître les bandes en quelques minutes mais l'intensité maximale de coloration est atteinte au bout de quelques heures. Les bandes sont rapidement plus visibles lorsque le gel est placé au réfrigérateur. Le gel est ensuite observé sur une lampe.

FIN !