Fluorescence a chemiluminiscence Skoumalov Vytek Srbov Luminiscence Emise

Fluorescence a chemiluminiscence Skoumalová, Vytášek, Srbová

Luminiscence Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního Fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je způsobena absorpcí záření Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí E S 0 S 1 T 1

Fluorescence a fosforescence

Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram) E Nezářivé přechody: VR - vibrační relaxace IC - vnitřní konverze ISC - mezisystémová konverze Zářivé přechody: Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S 1 S 0 (FL) spinově povolený přechod Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T 1 S 0 (Ph) spinově zakázaný přechod

Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii E = h. c/ Stokesův posuv http: //psych. lf 1. cuni. cz/fluorescence/soubory/principy. htm

Kvantitativní měření I 0 vzorek If It f = intensita fluorescence intensita absorpce = If Ia Ia = I 0 - It Kvantový výtěžek ( f ) < 1

Měření fluorescence • • • Fluorimetry Spektrofluorimetry Fluorescenční skenery Fluorescenční mikroskopy Průtokové cytometry zdroj excitační monochromátor vzorek emisní monochromátor detektor čtecí zařízení

Spektrofluorimetr

Spektrofluorimetr

Faktory ovlivňující citlivost fluorescence 1. Intenzita zdroje 2. Účinnost optického systému 3. Štěrbiny monochromátoru 4. Citlivost detektoru

Zdroje interference (chyb) 1. 2. 3. Efekt vnitřního filtru vrstvy vzorku vzdálenější od dopadu excitačního záření (dále v kyvetě) jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část záření je absorbována povrchovými vrstvami vzorku Zhášení excitovaná molekula se vrací do základního stavu nezářivým přechodem v důsledku srážky s molekulou zhášedla: O 2, halogeny (Br, I) Ramanovy peaky vibrační spektra pozorovaná ve viditelné a UV oblasti

Principy fluorescenčních stanovení 1. Přímé metody měříme přirozenou fluorescenci vzorku 2. Nepřímé metody nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát 3. Zhášecí metody sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku

Přirozené fluorofory • • • Polyaromatické uhlovodíky Vitamin A, E FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH NADH (340/460 nm) x NAD+ Karoteny Chinin Steroidy Aromatické aminokyseliny Nukleotidy Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein )

Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření)

Fluorescenční značky/sondy Látky jejichž fluorescence se po jejich zavedení do biologického systému nemění akridinová oranž (DNA) fluorescein (proteiny) rhodamin (proteiny) GFP Látky jejichž fluorescence se mění v závislosti na okolí ANS (1 -anilonaftalén-8 - sulfonát) - polarita prostředí Fura-2 – měření Ca

Příklady využití fluorescenční detekce • • Enzymové reakce Analýza DNA Genetické manipulace Imunochemické metody Transport membránou, fluidita membrán Proliferace buněk Apoptóza

Chemiluminiscence Luminol před přidáním H 2 O 2 Chemiluminiscence po přidaní H 2 O 2

Chemiluminiscence • Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí • Při návratu na základní úroveň dochází k vyzáření světla Bioluminiscence světluška Noctiluca scintillans ATP + luciferin + O 2 luciferáza Mg 2+ AMP + PPi + CO 2 + H 2 O + oxyluciferin + světlo

Chemiluminiscenční stanovení • Stanovení NO NO + O 3 NO 2* + O 2 NO 2* NO 2 + světlo • Stanovení H 2 O 2 nebo peroxidasy Luminol + H 2 O 2 Ag peroxidáza Ab 3 -aminoftalát + světlo využití v imunochemii