Fluorescence a chemiluminiscence Richard Vytek 2008 Luminiscence Emise
- Slides: 18
Fluorescence a chemiluminiscence Richard Vytášek 2008
Luminiscence Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního Fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je způsobena absorpcí záření Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí Jiné typy luminicence - triboluminiscence, katodoluminiscence, radioluminiscence E S 0 S 1 T 1
Fluorescence a fosforescence
Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram) E Nezářivé přechody: VR - vibrační relaxace IC - vnitřní konverze ISC - mezisystémová konverze Zářivé přechody: Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S 1 S 0 (FL) spinově povolený přechod Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T 1 S 0 (Ph) spinově zakázaný přechod
Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii E = h. c/ Stokesův posuv http: //psych. lf 1. cuni. cz/fluorescence/soubory/principy. htm
Kvantitativní měření I 0 vzorek If It f = intensita fluorescence intensita absorpce = If Ia Ia = I 0 - It Kvantový výtěžek ( f ) < 1 If = f. Ia = f (I 0 - It) It = I 0. 10 -ecd If = f. I 0(1 - 10 -ecd) ecd < 0, 01 If = 2, 3. f. e. d. c= . c 10 -ecd ln 10. (1 - ecd)
Závislost intensity fluorescence na koncentraci fluoreskující látky
Měření fluorescence • • • Fluorimetry Spektrofluorimetry Fluorescenční skenery Fluorescenční mikroskopy Průtokové cytometry zdroj excitační monochromátor vzorek emisní monochromátor detektor čtecí zařízení
Zdroje interference (chyb) 1. Efekt vnitřního filtru vrstvy vzorku vzdálenější od dopadu excitačního záření (dále v kyvetě) jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část záření je absorbována povrchovými vrstvami vzorku 2. Zhášení excitovaná molekula se vrací do základního stavu nezářivým přechodem v důsledku srážky s molekulou zhášedla: O 2, halogeny (Br, I)
Principy fluorescenčních stanovení 1. Přímé metody měříme přirozenou fluorescenci vzorku 2. Nepřímé metody nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát 3. Zhášecí metody sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku
Přirozené fluorofory • • • Lanthanidy Polyaromatické uhlovodíky Vitamin A, E FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH NADH (340/460 nm) x NAD+ Karoteny Chinin Steroidy Aromatické aminokyseliny Nukleotidy Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein )
Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření)
Fluorescenční značky/sondy Látky jejichž fluorescence se po jejich zavedení do biologického systému nemění akridinová oranž (DNA) fluorescein (proteiny) rhodamin (proteiny) GFP Látky jejichž fluorescence se mění v závislosti na okolí ANS (1 -anilonaftalén-8 - sulfonát) - polarita prostředí Fura-2 – měření Ca
Příklady využití fluorescenční detekce • • Enzymové reakce Analýza DNA Genetické manipulace Imunochemické metody Transport membránou, fluidita membrán Proliferace buněk Apoptóza
Chemiluminiscence Luminol před přidáním H 2 O 2 Chemiluminiscence po přidaní H 2 O 2
Chemiluminiscence • Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí • Při návratu na základní úroveň dochází k vyzáření světla Bioluminiscence světluška Noctiluca scintillans ATP + luciferin + O 2 luciferáza Mg 2+ AMP + PPi + CO 2 + H 2 O + oxyluciferin + světlo
Chemiluminiscenční stanovení • Stanovení NO NO + O 3 NO 2* + O 2 NO 2* NO 2 + světlo • Stanovení H 2 O 2 nebo peroxidasy Luminol + H 2 O 2 Ag peroxidáza Ab 3 -aminoftalát + světlo využití v imunochemii
Děkuji za pozornost
- Luminiscence
- 2008 2008
- Looking for richard analysis
- Atomic absorption spectrophotometer ppt
- Principles of fluorescence spectroscopy
- Chemiluminescence vs fluorescence
- Biotek flx800 fluorescence microplate reader
- Cold vapor atomic fluorescence spectrometry
- Fluorescence recovery after photobleaching
- Fluorescence units
- Fluorescence activated cell sorting
- Fluorescence-activated cell sorting (facs)
- Principle of fluorescence spectroscopy
- Jablonksi diagram
- Light sources for fluorescence microscopy
- Martin hof
- Fluorescence microscopy uses
- Fluorescence bandpass filter
- Confocal fluorescence microscopy