FIZIOLOGIJA BILJAKA VEBE Vebe iz ovog predmeta su
FIZIOLOGIJA BILJAKA - VEŽBE Vežbe iz ovog predmeta su laboratorijske, tj. eksperimentalne i traju 3 sata. Održavaće se petkom, od 8 do 20 h, u salama Instituta za fiziologiju i biohemiju, prema sledećem rasporedu – I grupa 09. 00 -11. 30, II grupa 11. 30 -14. 00, III grupa 14. 00 -17. 30, IV grupa 17. 30 -20. 00 Prisustvo na vežbama je obavezno. Dozvoljen je izostanak sa 1 termina vežbi (uključujući termine za kolokvijum), uz opravdanje. Kolokvijumi vezani za praktični deo kursa – 2, bez popravnog, min. 50% (Uslov za izlazak na kolokvijum su overene sve obrađene vežbe do datuma kolokvijuma) Kolokvijum vezan za teorijski deo kursa – 1 (Uslov za izlazak na kolokvijum su sve overene vežbe na kursu) Konsultacije po dogovoru, kontakt e-mail-om milorad@bio. bg. ac. rs – doc. dr Milorad Vujičić
BROJ VEŽBE I DATUM VEŽBE KOJE SE RADE U TERMINU 6. 10. II 13. 10. III 20. 10. IV 27. 10. V 3. 11. 10. 11. VI 17. 11. VII 24. 11. VIII 1. 12. IX 8. 12. 15. 12. 3. 1. Osmoza kroz membranu od bakar-heksacijanoferata (II) 3. 2. Difuzija kroz crevo za dijalizu 3. 3. Osmometar 3. 4. Uticaj temperature i organskih rastvarača na permeabilitet bioloških membrana 3. 5. Permeabilitet ćelijskih membrana za slabe i jake kiseline i baze 4. 1. Posmatranje toka plazmolize i deplazmolize 4. 2. Oblici i vreme plazmolize 4. 3. Plazmoliza u obliku kape (demonstrativna vežba) 5. 1. Određivanje vodnog potencijala biljnog tkiva na osnovu promene dužine odsečaka tkiva 5. 2. Određivanje osmotskog potencijala ćelijskog soka plazmolitičkom metodom 7. 1. Broj i raspored stoma 7. 2. Pokreti stoma 7. 3. Histohemijska lokalizacija kalijumovih jona u stominim ćelijama 8. 1. Antocijanini 8. 2. Antoksantini KOLOKVIJUM I (8 poena) 9. 1. 1. Razdvajanje fotosintetičkih pigmenata u rastvaračima koji se ne mešaju 9. 1. 2. Razdvajanje fotosintetičkih pigmenata hromatografijom na papiru 9. 1. 3. Snimanje apsorpcionih spektara fotosintetičkih pigmenata 9. 1. 4. Fluorescencija hlorofila u rastvoru 9. 1. 5. Fotosinteza in vivo 9. 1. 8. Detekcija fotosinteze i respiracije 11. 2. Izduživanje odsečaka hipokotila pod dejstvom auksina i niskog p. H – postavka (samo teoretski) 13. 1. 1. Efekat auksina na rizogenezu – postavka 13. 1. 2. Efekat auksina na apikalnu dominaciju – postavka 13. 2. 2. Efekat giberelina na izduživanje biljaka – postavka Rezultati vezbe VII 13. 2. 3. Interakcija giberelina i svetlosti u procesu izduživanja hipokotila salate – postavka 13. 3. 1. Efekat citokinina na retenciju hlorofila – postavka Rezultati vezbe IX KOLOKVIJUM II (12 poena)
Šta je potrebno za normalno pohađanje vežbi? • Fiziologija biljaka – Praktikum sa radnom sveskom Autori: Dragićević I. , Janošević D. , Cvetić Antić T. • Obavezno nošenje pribora za disekciju i kalkulatora • Radni (beli) mantil • Svaka vežba se overava u sledećem terminu vežbi. • Da bi bila overena, vežba mora da sadrži: • • Rezultate prikazane crtežom, grafički, ili tabelarno (zavisno od toga šta je asistent rekao o načinu predstavljanja rezultata), uz kratko objašnjenje Diskusiju dobijenih (a ne očekivanih) rezultata Zaključak Odgovori na pitanja na kraju vežbi nisu obavezni za overu vežbe, ali su pogodni za proveru znanja studenata.
Vežba I BIOLOŠKE MEMBRANE
BILJNA ĆELIJA Biljne ćelije su od spoljašnje sredine odvojene ćelijskim zidom i ćelijskom membranom, plazmalemom koja naleže sa unutrašnje strane na ćelijski zid.
HEMIJSKI SASTAV I STRUKTURA ĆELIJSKIH MEMBRANA Sve biološke membrane imaju sličnu strukturu i hemijski sastav, opisan tečno-mozaičnim (Singer-Nicholson-ovim) modelom Glikoprotein ØVoda ØLipidi Polarna glava fosfolipida – osnovni konstituenti membrane koji formiraju lipidni dvosloj ØProteini – asocirani, periferni ili integrisani ØUgljeni hidrati - u manjoj količini, nalaze se vezani za Hidrofobni lipide (glikolipidi) ili proteine repovi fosfolipida (glikoproteini) Integralni protein
BIOLOŠKE MEMBRANE Ø Plazmalema i tonoplast, kao i membrane mikrotela, sferozoma, lizozoma i endoplazmatičnog retikuluma su jednostruke. Ø Jedro, plastidi i mitohondrije imaju dvostruke ovojnice SVE BIOLOŠKE MEMBRANE SU SELEKTIVNO PROPUSTLJIVE
PROPUSTLJIVOST MEMBRANA Ø PERMEABILITET - Sposobnost membrane da pasivno propušta određene supstance Ø U odnosu na permeabilnost sve membrane se mogu podeliti na: • semipermeabilne ili polupropustljive membrane (veštačke membrane) propuštaju SAMO vodu (ne i supstance rastvorene u njoj) • diferencijalno propustljive membrane – imaju pore određene veličine i propustljive su samo za čestice rastvora čiji je prečnik manji od prečnika pora. To su uglavnom veštačke membrane (crevo za dijalizu) • selektivno propustljive membrane - (prirodne, biološke membrane) - “specijalan slučaj” diferencijalno propustljivih membrana. Razlika u propustljivosti, u odnosu na veštačke diferencijalno propustljive membrane, ogleda se u tome što se propustljivost bioloških membrana menja u vremenu, zavisno od faze životnog ciklusa i metaboličkih procesa u ćeliji
DIFUZIJA Difuzija je neto kretanje čestica niz gradijent koncentracije. U svim slučajevima kretanje se vrši dok se ne uspostavi ravnoteža. Posebni vidovi difuzije su osmoza i imbibicija.
OSMOZA Osmoza je difuzija vode kroz polupropustljivu membranu usled razlike u koncentraciji na dve strane membrane
3. 1. OSMOZA KROZ MEMBRANU OD BAKARHEKSACIJANOFERATA (II) Sloj bakar-heksacijanoferata (II) ima svojstvo polupropustljive membrane, jer propušta vodu, ali ne i soli rastvorene u njoj. Ova membrana nastaje na kontaktnim površinama rastvora kalijumheksacijanoferata (II) i bakar-sulfata: K 4 Fe(CN)6 + 2 Cu. SO 4 = Cu 2 Fe(CN)6 + 2 K 2 SO 4 Način rada: Sipati u epruvetu oko 5 ml rastvora Cu. SO 4 i pincetom ubaciti kristal K 4 Fe(CN)6. Posmatrati rast osmotske ćelije.
3. 2. DIFUZIJA KROZ CREVO ZA DIJALIZU Crevo za dijalizu je diferencijalno propustljiva membrana, koja zadržava krupne molekule kao što je skrob, a propušta male molekule poput vode i joda. Koristi se za odstranjivanje soli i molekula male molekulske mase iz rastvora makromolekula. Način rada: Crevo za dijalizu sa jedne strane čvrsto vezati končićem, sipati rastvor skroba i zatvoriti končićem “kesicu” pazeći da ne ostanu mehutrići vazduha. Crevo dobro isprati česmenskom vodom i staviti u čašu sa razblaženim Lugolovim rastvorom. Posmatrati promenu boje rastvora u crevu za dijalizu JOD ULAZI U KESICU
3. 3. OSMOMETAR Kako se osmoza odvija u biljnoj ćeliji može se prikazati pomoću (modifikovanog) Pfefferovog osmometra. Način rada: -Zapušiti uži kraj Pasterove pipete i napuniti je obojenim rastvorom šećera. -Na širi kraj pričvrstiti crevo za dijalizu pazeći da ne ostane vazduha u pipeti. -Pažljivo okrenuti pipetu i širim krajem je uroniti u epruvetu sa vodom. Zabeležiti promenu nivoa tečnosti u kapilari. Uočiti analogiju između osmometra i biljne ćelije.
FAKTORI KOJI UTIČU NA PERMEABILITET MEMBRANA Na permeabilitet bioloških membrana utiču fizički i hemijski faktori koji remete strukturu proteina, kompaktnost lipidnog sloja i rastvaraju lipide Temperatura, zračenje, p. H, koncentracija soli u okolnom rastvoru, gasovi, anestetici poput alkohola, etra, hloroforma. . . Oštećenja se mogu detektovati kao pojava jedinjenja u okolnom rastvoru za koja tonoplast i plazmalema nisu propustljivi u normalnim okolnostima.
Tonoplast vakuole Hloroplast Mitohondrije Plazmalem a Plazmalema § Plazmalema okružuje citoplazmu i ima glavnu ulogu u razmeni materija između spoljašnje sredine i unutrašnjosti ćelije § Tonoplast, membrana koja okružuje ćelijski sok (vakuolu), ima glavnu ulogu u razmeni materija između vakuole i citoplazme. § Plazmalema i tonoplast su selektivno propustljive membrane
Mnoge biljne ćelije sadrže u vakuolama pigmente antocijanine ili betalaine za koje su tonoplast i plazmalema nepropustljivi. Ako se ove membrane oštete pigmenti ističu iz tkiva u okolnu sredinu. Koncentracija pigmenta u okolnoj sredini, najčešće vodi, je mera za oštećenost membrana.
BILJNI PIGMENTI Biološki pigmenti selektivno apsorbuju određene talasne dužine svetlosti dok druge reflektuju. Apsorbovanu svetlost biljke koriste za pokretanje različitih hemijskih reakcija, dok reflektovana svetlost daje boju pigmentu. Fotosintetički pigmenti (nerastvorljivi u vodi) porfirini (hlorofili) Apsorbuju žutu i plavu svetlost, a reflektuju zelenu. Predstavljaju glavne fotosintetske pigmente. Nefotosintetički pigmenti (rastvorljivi u vodi) karotenoidi antocijanini betalaini Crvene, žute ili narandžaste boje. Fotosintetski pomoćni pigmenti. Od crvene do plave u zavisnosti od p. H. Daju boju različitim biljnim organima. Daju intenzivnu boju biljnim organima. Koriste se kao boje za hranu
BETALAINI Klasa crvenih i žutih pigmenata otkrivenih kod biljaka iz reda Caryophyllales i nekih pečuraka iz grupe Basidiomycota. Ime "betalain" dobili su od latinskog imena za repu (Beta vulgaris), iz koje je ova vrsta pigmenata po prvi put ekstrahovana. kaktus Mammillaria Beta vulgaris Amaranthus caudatus Postoji međusobno isključivanje antocijanina i betalaina. Od svih familija iz ovog reda samo familije Caryophyllaceae i Molluginaceae sintetišu antocijanine umesto betalaina.
Betalaini se mogu akumulirati u bilo kom delu biljke, kao što su peteljke, cvetovi, plodovi, stabla i korenovi. betaksantini betacijanini Beta vulgaris subsp. maritima
CILJ Utvrditi faktore koji utiču na propustljivost membrana ćelija cvekle.
CVEKLA KAO MODEL • Cvekla sadrži kompleksnu smesu betalain pigmenata. • Ona sadrži dva glavna betalaina: betanin (crven) i vulgaksantin (žut). Karakteristična purpurno-crveno-ljubičasta boja cvekle je uglavnom od betacijanina betanina, najbolje proučenog pigmenta iz ove grupe. • Korenovi cvekle sadrže preko 0, 21% betanina i oko 0, 14% vulgansantina.
3. 4. Uticaj temperature i organskih rastvarača na permeabilitet bioloških membrana Iz svežeg korena cvekle izvaditi cilindre tkiva pomoću bušača i iseći na odsečke duge 1 cm (ukupno 20 odsečaka). Po 5 odsečaka upakovati u gazu i vezati čvrsto koncem tako da se naprave kesice od gaze sa odsečcima cvekle. 3 kesice isprati tekućom vodom (veoma kratko), kako bi se uklonili tragovi pigmenta koji je iscurio • Jednu ispranu kesicu ubaciti u epruvetu sa 5 ml destilovane vode, tako da cela kesica bude u vodi i staviti da stoji na sobnoj temperaturi. Zabeležiti vreme. Ovo je kontrola. • Preostale 2 isprane kesice uroniti (držeći kesicu za kraj konca) u vodena kupatila sa različitim temperaturama vode (40, i 90 °C) tokom tačno jednog minuta pa odmah prebacivati u epruvete sa po 5 ml destilovane vode i držati na sobnoj temperaturi. Svaka od kesica treba tačno 30 minuta da bude u epruveti sa destilovanom vodom!
Preostalu kesicu sa 5 odsečaka svežeg tkiva korena cvekle ubaciti, bez ispiranja tekućom vodom, u epruvetu sa 5 ml odgovarajućeg nerazblaženog organskog rastvarača (etanola, acetona, odnosno petrol etra). Dodatno pripremiti jednu kesicu sa 5 odsečaka uzetih iz zamrzavanog tkiva korena cvekle i bez ispiranja odmah ubaciti u epruvetu sa 5 ml destilovane vode, tako da cela kesica bude u vodi. Ostaviti da stoji na sobnoj temperaturi (20 °C). Svaka od kesica treba tačno 30 minuta da bude u epruveti sa destilovanom vodom!
• Po isteku 30 minuta od uranjanja u tečnost, izvaditi kesice iz svih epruveta (ocediti ih od nakupljene tečnosti prilikom izbacivanja) i zabeležiti zapažanja o boji tečnosti u pojedinim epruvetama.
Očekivani rezultati • Količina pigmenta koja je iscurela iz tkiva, srazmerna je broju oštećenih ćelija. Povišena temperatura dovodi do denaturacije proteina. • Organski rastvarači dovode do rastvaranja lipidne komponente membrane • Iz ćelija koje su bile zamrznute, pigment takođe brzo izlazi, jer dolazi do stvaranja leda u samim ćelijama koji oštećuje membrane
3. 5. Permeabilitet ćelijskih membrana za slabe i jake kiseline i baze • Biološke membrane su nepermeabilne za naelektrisane čestice (jone i molekule), te se transport velikih, hidrofilnih i naelektrisanih molekula i jona kroz membranu odvija posredstvom membranskih proteina sa transportnom funkcijom Antocijanini Kiselo Supstance koje dobro disosuju u vodi (jake kiseline i baze) teže prolaze kroz ćelijske membrane nego supstance koje slabo disosuju (slabe kiseline i baze). Pigmenti rastvoreni u vakuolama biljnih ćelija, u određenom opsegu p. H menjaju svoju boju i ponašaju se kao p. H indikatori prodiranje kiselina i baza kroz tonoplast može se detektovati na osnovu promene boje Kiselo Bazno BETALAINI Bazno
Permeabilitet ćelijskih membrana za slabe i jake kiseline i baze Način rada: • 5 odsečaka uroniti u 5 ml sirćetne kiseline, • 5 odsečaka uroniti u 5 ml KOH. • Nakon 1 minut odliti rastvore i doliti po 5 ml destilovane vode. Zabeležiti vreme. • Nakon 30 minuta od potapanja izvaditi odsečke i arbitrarno odrediti obojenost rastvora u epruveti
- Slides: 27