FISH Fluorescent In Situ Hybridization Hibridao Fluorescente In
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Hibridação Fluorescente In Situ
FISH • avanços na utilização de técnicas moleculares • identificar e quantificar grupos microbianos • amostra ambiental, biofilmes e lodo granular • localização e organização espacial das células Habitat natural Cultivo prévio
FISH sonda de oligonucleotídeo marcada regiões específicas de RNAr hibridiza seqüências complementares do RNA sinal fluorescente visualização microscopia de fluorescência
FISH RNAr são alvos atrativos porque possuem múltiplas cópias por células aumento do sinal da sonda é proporcional a quantidade do alvo RNAr presente indica atividade metabólica da célula
Etapas 1. Fixação 2. Manter a integridade celular Tornar as células permeáveis para as sondas de oligonucleotídeos 2. Hibridação Sonda marcada penetra nas células 4. Detecção 3. Lavagem Remover sonda não ligada em locais não específicos Quantificação e identificação
FISH
Problemas com FISH • Quantificação Problema: microscópica coletar células suficientes para a detecção Solução: concentrar a amostra fácil: amostras aquáticas podem ser filtradas difícil: amostras de sedimentos e solos remover partículas não celulares e depois concentrar
Problemas com FISH • Atividade metabólica Problema: baixa intensidade de sinal poucas moléculas de RNAr (típico de ambientes oligotróficos (taxa de crescimento lenta) Solução: - testar mais fluoróforos
FISH: vantagens e desvantagens Vantagens • quantificação e identificação dos microrganismos • estudo da organização espacial das células em seu habitat natural • estudo da composição atual de uma comunidade • não requer cultivo prévio antes da análise • não necessita de células vivas • intensidade da fluorescência é diretamente medida em células com atividade • células inativas têm baixa intensidade de fluorescência
FISH: vantagens e desvantagens Desvantagens • preparação complexa confeccionar sonda para identificar seqüências específicas de nucleotídeos • difícil quantificação de agrupamentos de células • difícil quantificação devido partículas inorgânicas e polímeros • requer muito tempo e testes preliminares da amostra
*Seqüência de bases obtidas em AMANN et al. (1995) **Numeração baseada no RNAr de E. coli (BROSIUS et al. , 1981)
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