Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymw i biaek terapeutycznych wysokiej

Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości

Produkcja enzymów

Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego 1. Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk i obszar induktorowy. Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk). W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora. Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C. Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L 2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji.

Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania --------------------------------------------------------Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol lub Brevibacterium spp. Kreatynaza Pseudomonas spp. Kreatyna Kreatyninaza j. w. Kreatynina -galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISA Oksydaza glukozowa Aspergillus niger Glukoza Dehydrogenaza Glc-6 -P Leuconostoc mesenteroides Glukoza -glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazy Oksydaza glicerolo-3 -P Aerococcus viridians Triacyloglicerole Heksokinaza S. cerevisiae Glukoza Peroksydaza Chrzan Enzym wskaźnikowy, testy ELISA Oksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. Pirogronian, transaminazy Oksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae Kwas moczowy Ureaza Klebsiella aerogenes Mocznik

Białka rekombinowane terapeutyczne Białko Leczona choroba Rok zaakceptowania ---------------------------------------------------------Insulina Cukrzyca 1982 Ludzki hormon wzrostu Karzełkowatość 1985 Interferon alfa Wirusowe zapalenie wątroby niektóre nowotwory 1986 Szczepionka przeciwko wirusowemu zap. wątroby typu B Zapobieganie WZW typu B 1986 Aktywator plazminogenu Zawał serca, zator naczyniowy 1987 Erytropoetyna Anemia związana z niewydolnością nerek 1989 Interferon gamma Chroniczna granulomatoza 1990 Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przeszczepach szpiku 1991 Czynnik krzepliwości VIII Hemofilia A 1992 Interferon beta Stwardnienie rozsiane 1993 DNaza Zwłóknienie torbielowate 1994 Glukocerebrozydaza Choroba Gauchera 1994 Czynnik krzepliwości IX Choroba Christmasa 1997 Interleukina-10 Zapobieganie trombocytopenii 1997

Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane przez zwierzę transgeniczne Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku w Europie przez Europejską Agencję do spraw Leków (EMEA) w roku 2006. Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący antyrombinę – białko hamujące patologiczne krzepnięcie krwi. Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu genetycznym (1 raz na 5 tys. osób). Jedna koza może zastąpić 90 000 ludzkich dawców krwi.

Naturacja białek z ciał inkluzyjnych Problem tworzenia agregatów podczas fałdowania białek 1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w roztworze 6 -8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Insulina Genentech, Eli Lilly 1. 2. 3. Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą; Rozszczepienie bromocyjanem; Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację Novonordisk Ekspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Gensulin (BIOTON) Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy Ekspresja w Escherichia coli Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95% Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99, 9%