Fermentacijsko pridobivanje izolacija in karakterizacija gramicidina peptidnega antibiotika

Fermentacijsko pridobivanje, izolacija in karakterizacija gramicidina, peptidnega antibiotika iz bakterije Brevibacillus parabrevis ATCC-8185 8. vaja pri predmetu Farmacevtska biotehnologija (EMŠ Farmacija) Petra Zadravec mail: petra. zadravec@ffa. uni-lj. si

Uvod ü G+ bakterije ü Aerobne/ fakultativno anaerobne ü Sporogene Katere poznamo? Rod Bacillus Sekundarni metaboliti Antibiotiki, pigmenti, toksini, ekološki efektorji, feromoni, encimski inhibitorji, pesticidi, protitumorske učinkovine Funkcija?

Antibiotiki • Glede na strukturo poznamo različne skupine antibiotikov. Katere? ü ü ü ß-laktamski Tetraciklini Makrolidi Aminoglikozidi Kinoloni… • Osnovna principa delovanja Tarče? üSinteza celične stene http: //amrls. cvm. msu. edu/pharmacology/antimicrobials üBiosinteza proteinov üPodvojevanje in popravljanje DNA üBiosinteza folata üOstalo (npr. tvorba por – nisin , gramicidin)

Brevibacillus parabrevis ATCC-8185 Tirotricin = linearni gramicidin + ciklični tirocidin Razmerje? = 1 : 4 Funkcija? Uravnava proces sporulacije Kdaj pride do sporulacije? Endospore

Struktura gramicidina ü Izmenjujoče L- in D- AK ü Hidrofobne stranske verige

Delovanje in uporaba gramicidina ü V poltrdnih FO za zdravljenje bakterijskih okužb kože Zakaj ga ne uporabljamo pri sistemskih okužbah? kontrola ü Ionski kanalček selektivno propusten za monovalentne katione ü Porušen ionski gradient etanol gramicidin D SDS ü Modelni membranski kanalček ü V elektrofiziologiji za naluknanje membrane

Biosinteza gramicidina NERIBOSOMSKE PEPTIDNE SINTETAZE = enota, ki izvede pripojitev posamezne AK v nastajajočo polipeptidno verigo Osnovni modul Funkcije posameznih domen? Domena Adenilacijska domena (A) – izbor in aktivacija AK Tiolacijska domena (T ali PCP) – peptidil nosilni protein Kondenzacijska domena (C) – tvorba peptidne vezi Epimerizacijska domena (E) – epimerizacija AK Tioesterazna domena (TE) – zaključitev verige

Primer NRPS sinteze tirocidina

V razmislek… • Skiciraj domenske strukture teoretične peptidne sintetaze, ki bi katalizirala sintezo tripeptida : L-Pro-D-Phe-L-Glu

Pridobivanje gramicidina • Fermentacijsko z gojenjem Bacillus parabrevis ATCC 8185. • 1 % posneto mleko. • 37 °C za vsaj 16 ur. • Dolga fermentacija izzove sporulacijo. • Nastajanje gramicidina domnevno okrepijo razgradni produkti hidrolize kazeina v mleku, ki jo vodi še neidentificirane proteaza.

Praktični del: Liza termoblok supernatant 750 µL absolutnega Et. OH

Praktični del: Adsorpcijska kromatografija 2 a. Ekvilibracija z 2 m. L 85 % Et. OH b. Dodatek celičnega lizata c. Elucija z 1, 5 m. L 85 % Et. OH 3 Medtem priprava celičnega lizata Takoj zbiranje frakcij po 200 µL (E 1 -E 12)

Praktični del: Spektrofotometrična določitev 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 E 6 E 7 E 8 E 9 E 10 E 11 E 12 X X X X X A B eluati C D E S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 F standardi G X X X H X X X • Pripravite standarde (S 1 -S 9) ustreznih koncentracij: 0, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600 µg/m. L v 85 % Et. OH • Po 50 µL eluatov ter standarda v vsako vdolbinico Ø Dodatek: 50 µL Ehrlichovega reagenta + 5 µL 0, 1 % KNO 2 10 min inkubacija Pomerimo A pri 660 nm

Detekcija Zakaj barvamo z Ehrlichovim reagentom?

Praktični del: Tankoplastna kromatografija Nanos vzorcev po 10 µL: celičnega lizata, Stand G, Stand T, E (kjer je prisoten G) CL G T E 6 E 7 E 8 1 cm MF: metanol : butanol : voda : ledocet : butilacetat = 3 : 9 : 15 : 24 : 49

Razvijemo do 2/3 Detekcija analitov z Ehrlichovim reagentom Posušeno TLC ploščico potopimo v Ehrlichov reagent Posušimo nad kuhalno ploščo

Praktični del: Antibiotična aktivnost Nanos: ü PK- standard gramicidina ü NK- PBS pufer ü Izoliran gramicidin Lactococcus lactis (grampozitivna bakterija)