FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA No
FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA No âmbito de: BIOQUÍMICA I (1º ano) MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS SEMINÁRIO ORIENTADO 3 – SO 3 Turma 2
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS SUMÁRIO 1. Noção básica de propriedades dos lípidos, remetendo para aquelas com interesse no uso de métodos de extracção e identificação 2. Comunicação de diferentes métodos de extracção de lípidos em amostras biológicas 3. Comunicação de diferentes métodos de análise de lípidos que possibilitem a sua identificação 4. Comunicação de exemplos do estudo dos lípidos no diagnóstico médico
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS Ø São, LÍPIDOS maioritariamente: − Ésteres de ácidos gordos Propriedades − Amidas de ácidos gordos Ø Moléculas orgânicas com: ‒ Baixa solubilidade em água e outros solventes polares ‒ Alta solubilidade em solventes apolares Por serem insolúveis em solventes polares, os lípidos são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o extracelular, francamente hidrófilos.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS RESERVA MEMBRANARES (LÍPIDOS APOLARES) (POLARES) FOSFOLÍPIDOS GLICEROFOSFOLÍPIDOS Ácido gordo Glicerol Ácido gordo Esfingosina Ácido gordo PO 4 ESFINGOLÍPIDOS Álcool GLICOLÍPIDOS EX : ESFINGOLÍPIDOS COLESTEROL Ácido gordo PO 4 ESTERÓIS Álcool Esfingosina TRIGLICERÍDEOS Ácido gordo Mono- ou oligossacaríde o
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODOS DE EXTRACÇÃO Ø Método de Folch Ø Cromatografia ‒ Cromatografia em camada fina (TLC)
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODO DE FOLCH Ø Realiza-se uma homogeneização do tecido com clorofórmio e metanol na proporção de 2: 1. Ø Adiciona-se água ou um sal apropriado à solução. Ø A mistura resultante fica dividida em duas fases. Ø Na fase inferior encontram-se os lípidos puros. Durante o processo de lavagem, vai ser perdida alguma percentagem de material lipídico.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS CROMATOGRAFIA Ø Baseia-se na interacção de uma amostra com uma fase estacionária e uma fase móvel. Ø A fase estacionária (matriz) permanece imóvel durante a separação, enquanto a fase móvel, que constitui o eluente, permite a separação dos componentes da amostra consoante a sua afinidade. Ø Os vários componentes da amostra interagem, essencialmente, por: - Afinidade de carga; - Polaridade.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ERA UMA VEZ… A M A M M M A A
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ERA UMA VEZ… M M M A A AAA A A M M M
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA Ø As substâncias da mistura são transportadas a certas distâncias e, desta forma, separadas. Ø Permite identificar substâncias desconhecidas através da comparação com padrões (caso eles existam) e isolar os diferentes componentes de uma mistura. Ø Fase estacionária – camada fina de ácido de silício (por Migração de um solvente (a) e de um componente da amostra (b). exemplo) sobre suporte de vidro, adsorvente muito polar e, como tal, os fosfolípidos (por exemplo) possuem grande afinidade para ele. Ø Fase móvel – solvente (clorofórmio+metanol+água) com afinidade para os fosfolípidos
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODOS DE ANÁLISE Ø Teste de Iodo Ø Teste de Liebermann-Burchard Ø Espectrometria de massa Ø Teste enzimático ‒ Identificação da esfingomielina
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE DO IODO Ø Identifica a presença de ácidos gordos insaturados através de uma reacção de halogenação. Ø Se houver dupla ligação, o iodo será consumido e a coloração característica (azul) da solução de iodo diminuirá de intensidade. Ø Pode-se quantificar os ácidos gordos insaturados através de uma titulação com uma solução de iodo.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE DE LIEBERMANN-BURCHARD Ø Identificar e quantificar o "colesterol total" (colesterol + ésteres do colesterol). Ø Tem como fundamento a reacção do colesterol e dos seus ésteres com anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado, da qual resulta a formação de um complexo corado de azul esverdeado, cuja intensidade da cor é directamente proporcional à concentração de colesterol.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ESPECTROMETRIA DE MASSA Ø Um composto é ionizado (uma molécula de carga nula é bombardeada por electrões). Ø Os iões são separados atendendo à base da razão da massa pela carga. Ø Identifica entidades massa/carga (que correspondem a compostos) devidamente separadas umas das outras e expressa esses achados de maneira gráfica (espectro). Ø Muitas vezes acoplada à cromatografia.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE ENZIMÁTICO Ø Através de reacções enzimáticas específicas com a amostra anteriormente isolada, obtêm-se produtos que emitem, por exemplo, fluorescência. IDENTIFICAÇÃO DA ESFINGOMIELINA Ø Importante componente lipídico da membrana celular. Ø É baseado na actividade enzimática da esfingomielinase. Ø Esfingomielinase bacteriana é primeiramente usada para hidrolisar a esfingomielina. Ø Ocorrem, posteriormente, uma série de reacções enzimáticas que resultam na formação de um produto altamente fluorescente, a resorufina.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS EXEMPLOS DO ESTUDO DE LÍPIDOS NO DIAGNÓSTICO MÉDICO Ø Doença de Niemann-Pick Ø Hipercolesterolemia
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS NIEMANN-PICK Doença sem tratamento (segundo um trabalho de licenciatura de uma aluna de bioquímica tutorado pelo Prof. Doutor Hassan Bousbaa). Ø As formas tipo A e B da doença de Niemann-Pick são causadas pela deficiente actividade da esfingomielinase. Ø Os pacientes desta doença possuem valores de esfingomielina 4 a 15 vezes mais elevados que um indivíduo normal, dependendo do tecido em análise. Ø Leva à hipertrofia do baço e do fígado e a lesões nervosas graves (Tipo A) DIAGNÓSTICO Realizado a partir da análise dos níveis de esfingomielina em amostras de tecidos (biopsia ao baço ou fígado).
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS HIPERCOLESTEROLEMIA Ø Patologia que se caracteriza pelos níveis elevados de colesterol no sangue Ø É um dos factores envolvidos no desenvolvimento da arterosclerose, devido à acumulação de colesterol na corrente sanguínea Ø Tem como causa maior a prática de hábitos alimentares inadequados DIAGNÓSTICO Realizado a partir da análise dos níveis de colesterol no sangue.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS HIPERCOLESTEROLEMIA Tratamento Ø Uma alimentação saudável, com baixo teor em gorduras saturadas. Ø Estatinas ( inibidor da enzima que catalisa a reacção de formação do colesterol) Acetyl-Co. A 3 -Hydroxy-3 -methylglutaryl-Co. A HMG-Co. A reductase Squalene Cholesterol + Lecithin LCAT Mevalonate Cholesterol ester “Statin” drugs inhibit this enzyme
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS BIBLIOGRAFIA Ø Propriedades e classes de lípidos ‒ STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L. ; BERG, Jeremy M. – Bioquímica – 5ª ed. ; Rio Janeiro: Guanabara Koogan , 2004 ; pág. 333 -344, 754 -755 Ø Métodos de extracção ‒ ‒ Ø Métodos de análise ‒ ‒ ‒ ‒ Ø http: //www. cyberlipid. org/extract/extr 0001. htm http: //www. lipidlibrary. co. uk/topics/extract/index. htm http: //jacintocastanho. planetaclix. pt/cromatografia. htm http: //www. infopedia. pt/$cromatografia http: //www. cyberlipid. org/cyberlip/home 0001. htm http: //www. apmaldi. com/Applications/Spectra/Lipids_Spectrum 2. jpg http: //www. dbm. ufpb. br/DBM_bioquimica_monitoria. htm http: //www. dq. fct. unl. pt/cadeiras/bio-A/main/aula 09_08_09(lipidos). pdf http: //www. dqb. fc. ul. pt/docentes/fduarte/espectrometria_de_massa_de_elect. htm http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/12069422? dopt=Abstract Exemplos do estudo de lípidos no diagnóstico médico ‒ ‒ ‒ http: //www. cyberlipid. org/cyberlip/home 0001. htm http: //www. ess. ips. pt/escola/Bioquimica/8 CLE/GRUPO 9/9. 8. pdf http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/12069422? dopt=Abstract
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