Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Mestrado

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Mestrado Integrado em Medicina – Bioquímica I Ana Sousa Filipa Carvalho Filipa Sotero Filipa Reis Ana Lopes Ana Moreira Ana Augusto Filipa Figueiredo Seminário Orientado nº 3 MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS 7 -10 -2009

Objectivos propostos: 1. Analisar diferentes métodos para extracção de lípidos em amostras biológicas; 2. Discutir diferentes métodos de análise de lípidos, incluindo a sua identificação; 3. Explicar exemplos do estudo de lípidos para o diagnóstico em Medicina.

Breve noção sobre a bioquímica dos lípidos Elementos das membranas biológicas Biomoléculas orgânicas Reservas nutritivas Importantes funções biológicas LÍPIDOS Insolúveis em água Solúveis em solventes orgânicos (polares e/ou apolares) Quimicamente são ésteres Protecção Reconhecimento e Imunidade Intensa actividade biológica

EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS Aspectos a ter em conta: § As características dos lípidos facilitam a separação de proteínas e açúcares; § A polaridade dos grupos químicos do lípido condiciona a polaridade do solvente; 9 lípidos com grupos polares são mais solúveis em álcoois do que em hexano. § Pode ser necessário quebrar ligações com outros componentes da molécula. Preparação das amostras para extracção: § Evitar as condições oxidantes no armazenamento (oxigénio, luz e temperatura); § Pré-secagem; § Moagem; § Hidrólise ácida.

Métodos de extracção de lípidos COM SOLVENTES § Extracção contínua: Método de Goldfish § Extracção semicontínua: Método de Soxhlet § Extracção descontínua: Método de Mojonnier e Método de Roese-Gottlib § Extracção de alta pressão: 9 Extracção acelerada com solventes 9 Extracção com fluidos supercríticos § Método de Bligh-Dyer e Método Reed et al. § éter etílico; Solventes mais comuns § éter de petróleo; § hexano; § pentano; § clorofórmio; § acetona; § benzeno.

Métodos de extracção de lípidos COM SOLVENTES Lípidos apolares solventes apolares (hexano, éteres) Lípidos polares misturas de solventes polares e apolares (metanol, clorofórmio) Características ideais do solvente: - Grande poder solvente; - Não solubilizar proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono; - Evaporar rapidamente; - Penetrar rapidamente nas partículas da amostra; - Não inflamável; - Atóxico; - Baixo custo; - Não higroscópico (sem capacidade de reter água).

Métodos de extracção de lípidos com solventes A QUENTE Adaptado de Inar Castro, 2006 (Fac. Ciências Farm, Universidade São Paulo). MÉTODO DE GOLDFISH Pesagem da Amostra Extracção de Lípidos com Solvente (≈ 8 h no extractor) Evaporação do Solvente Pesagem da Gordura Extraída § Utiliza refluxo de solvente para extracção; § Processo de extracção contínuo, logo, mais rápido; § Pode ser utilizado somente com amostras sólidas. Vantagem: utiliza menos solvente e é mais rápido, pois, sendo contínuo, faz com que a amostra esteja permanentemente em contacto com o solvente. Desvantagem: o contacto do solvente muito quente com a amostra pode levar à degradação da gordura. Cálculo de Teor Lipídico % Lípidos = peso final balão – peso inicial balão x 100 peso amostra

Métodos de extracção de lípidos com solventes A QUENTE MÉTODO DE SOXHLET § Utiliza refluxo de solvente para extracção; § Processo de extracção intermitente; § Só pode ser utilizado com amostras sólidas; § A quantidade de solvente é maior para que o volume total seja suficiente para atingir o sifão do equipamento. Vantagem: a amostra não fica em contacto directo com o giangarloscientific. com solvente em ebulição, evitando-se a decomposição dos lípidos. Desvantagem: possível saturação do solvente o que dificulta a extracção. Legenda: (1) recipiente do solvente (3) funil (2) recipiente de extracção (4) condensador

Métodos de extracção de lípidos com solventes A FRIO MÉTODO DE BLIGH-DYER § Utiliza uma mistura a frio de três solventes: clorofórmio, metanol e água; § As amostras são avaliadas quanto ao nível de peroxidação e perfil de ácidos gordos; § Pode ser usada para qualquer tipo de amostra (seca ou húmida). Procedimento: Adaptado de Inar Castro, 2006 (Fac. Ciências Farm, Universidade São Paulo).

Métodos de extracção de lípidos SEM SOLVENTES Métodos de Babcock e de Gerber: Digestão com ácido Adição de álcool isoamílico (Gerber) Colocação em recipiente de medida Centrifugação e leitura Métodos instrumentais: Ressonância magnética nuclear Medida da constante dieléctrica Espectroscopia de infravermelho Medidas de densidade Medidas da velocidade do som Método colorimétrico (reacção com o ácido hidroxâmico)

Métodos de extracção de lípidos SEM SOLVENTES MÉTODO DE GERBER § Apenas utilizado em leite e produtos lácteos. Estrutura do leite Emulsão Filme proteico x 1000 Digestão proteica (libertar gordura) Ácido sulfúrico / álcool isoamílico Centrifugação directa no butirómetro a 71ºC X 10000 Leitura final no butirómetro

Métodos de identificação de lípidos Método físico-químico de separação baseado na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interacções entre uma fase móvel e outra estacionária. Crom. gás-sólido ou de partição § Cromatografia Gasosa Crom. gás-líquido ou de absorção § Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Crom. Gasosa de alta resolução Cienciamao. if. usp. br § Cromatografia em Camada Fina

Importância da extracção de lípidos Permite fazer a análise do teor lipídico de amostras biológicas, incluindo alimentos: § Padrões de identificação e rotulagem; Hortibrasil. org. br § Investigação e diagnóstico.

Importância da extracção de lípidos ESTUDO DOS LÍPIDOS E DIAGNÓSTICO EM MEDICINA § Hipo ou Hipertiroidismo a glândula da tiróide exerce controlo sobra a concentração de lípidos no plasma sanguíneo. Hipotiroidismo – lipaemia; Hipertiroidismo – lipopenia; § Doenças do sistema nervoso central a desregulação do metabolismo dos lípidos pode influenciar distúrbios neurológicos: bipolaridade e esquizofrenia, e doenças neurodegenerativas: Alzheimer, Parkinson e Niemann Pick; § Fibrose cística relacionada com dislipidemia hipertrigliceridemia, diminuição da ácidos gordos essencias (hipocolesterolemia normalmente) ; § Hipercolesterolemia familiar transporte e metabolismo do colesterol. deficiência do metabolismo lipídico, nomeadamente o

Referências bibliográficas Suporte escrito NELSON, David L. . COX, Michael M. . Lehninger: Principles of Biochemistry. Nova Iorque: W. H. Freeman and Company. Fifth Edition. MURRAY, Robert K. . GRANNER, Daryl K. et all. (1998). Bioquímica de Harper. México: El Manual Moderno. 11ª edição. SILVA, Ana. (2008). Notas de campo. Disciplina de Bioquímica. (Não publicado) Suporte informático http: //www. uac. pt/~barreto/bqm_prat/prot 04 a. Ext_lipidos_introd. pdf http: //www. gipescado. com. br/arquivos/met_fis-qui_ial/cap 25. pdf http: //www. sitebiomedico. hpg. ig. com. br/proteinas. htm http: //ojs. c 3 sl. ufpr. br/ojs 2/index. php/alimentos/article/view/7489/5359 http: //www. aapsj. org/view. asp? art=aapsj 080236