Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Biomarcadores

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Biomarcadores e Doenças Neuro-degenerativas SO 2 Bioquímica II Adriana Sarmento Adriana Martins Adriano Grangeia Adriano Agostinho Alberto Marques Alexandra Dias Alexandra Carvalho Alexandre Afonso Alice Longras

Objectivos 1 - Explicar o que são biomarcadores 2 - Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou líquido cefalo-raquídeo (LCR) em doenças neurodegenerativas: proteína 14 -3 -3, proteína tau, beta-amilóide, etc. ; 3 - Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula; 4 - Analisar e discutir os métodos de detecção 5 - Relacionar a análise da proteína 14 -3 -3 com o diagnóstico das doenças humanas por priões.

Um biomarcador é…. . . uma característica que é objectivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogénicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Pode ser: -uma substância que é introduzida num organismo para analisar a função de um órgão ou outros aspectos da saúde; -pode ser uma substância cuja detecção indica um estado de doença específica, por exemplo, a presença de um anticorpo pode indicar uma infecção;

-podem ser detectados e medidos em partes do corpo como o sangue ou tecido. Eles podem indicar tanto os processos normais ou doentes no corpo; -pode ser específico de células, moléculas, ou genes, produtos de genes, enzimas e hormonas; -podem ser funções de órgãos ou alterações características nas estruturas biológicas; -utilizados em pesquisas pré-clínicas e diagnóstico clínico por um tempo considerável.

Biomarcadores β-amilóide Proteína Tau Proteína 14 -3 -3

Biomarcadores e Doenças Neuro-degenerativas -Os biomarcadores estão a ser cada vez mais valorizados para auxiliar no diagnóstico, na terapia e na investigação das doenças neuro-degenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). -As causas de muitas destas patologias ainda não estão definitivamente descobertas e a sua fase inicial é muitas vezes caracterizada pela ausência de sintomas expressivos. -Apesar da existência de testes neuropsicológicos desenvolvidos, eles são muitas vezes complexos e não conseguem diferenciar claramente as alterações cognitivas próprias do envelhecimento normal das manifestações dos sinais iniciais da DA. - Por isso, justifica-se a crescente importância na pesquisa de biomarcadores para auxiliar o diagnóstico.

Caso concreto: Doença de Alzheimer Pensa-se que a doença de Alzheimer, causada pela morte progressiva de neurónios, é originada pela acumulação anormal de: Beta-amilóide - “placas” (ou agregados) formadas pela proteína insolúvel betaamilóide enovelada (“folded”) no meio extra-celular. • bloqueiam as sinapses, • contribuem para a formação de radicais livres, • estimulam a inflamação (entre outras coisas) Protéina Tau -depósitos da proteína Tau hiperfosforilada no meio intra-celular. Esta proteína, que é uma moduladora da estabilidade dos microtúbulos, quando fica hiperfosforilada… • contribuiu para a destabilização e destruição do citoesqueleto, que é fundamental para a sobrevivência das células

Assim sendo, os biomarcadores com maior potencial são aqueles que estão associados a estas duas proteínas. Nos doentes com DA: níveis da beta-amilóide níveis de Tau (em relação aos indivíduos cognitivamente normais) • A combinação dessa análise laboratorial com o diagnóstico clínico (muito baseado em testes neuropsicológicos) demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade para identificar aqueles que evoluirão para DA. • Estes biomarcadores são extraídos do líquido céfalo-raquídeo (LCR), cuja recolha é feita por punção lombar.

Proteína UBIQUITÁRIA Proteína 14 -3 -3 Presente em todas as células eucarióticas, principalmente no SNC. Apresenta 7 isoformas nos mamíferos. Biomarcador para doenças priónicas. Funções: • Sinalização, • Crescimento/proliferação celular • Divisão • Adesão • Diferenciação • Apoptose • Regulação dos canais iónicos.

Proteínas que podem alterar a conformação de outras proteínas Prião É uma glicoproteína ancorada à membrana plasmática Funções: • Comunicação entre as células nervosas, • manutenção intracelular dos iões Cu 2+, • protecção contra o stress oxidativo, • apoptose celular Mutações do gene PRNP (c 20) leva a uma alteração conformacional da Pr. Pc tornando-se Pr. Psc. Pr. Pc + Pr. Psc

Pr. Pc e Pr. Psc • solúvel • insolúvel • degradável por proteases • resistente a proteases • 42% α-hélice e 3% folha β • 30% α-hélice e 43% folha β • Auto-replica-se no interior do organismo • forma placas de β-amiloide nos neurónios levando à morte

Doenças do Prião • Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) • Kuru • Nova variante da CJD (nv. CJD) • Insónia Fatal Familiar (FFI) • Síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS)

Doença de Creutfeld-jakob Pode apresentar 4 diferentes formas Sintomas Diagnóstico • CJD esporádica • CJD familiar • CJD iatrogénica • CJD nova variante- por ingestão de alimentos (BSE) contaminados • Espasmos musculares • Alterações comportamentais e cognitivas • Demência • Morte em menos de 1 ano nas formas clássicas e em 2 anos na nova variante • Análise dos sintomas • EEG • Detecção da protéina 14 -3 -3 no LCR • Diagnóstico definitivo: biópsia para detecção da Pr. Psc ou autópsia

Que proteinas podemos encontrar no LCR de um doente com CJD? • Ubiquitinas • NSE (neuron specific enolase) • S 100 B • Proteína tau Única que permite o diagnóstico de CJD • PROTEINA 14 -3 -3 Porque as outras proteínas também são encontradas no LCR de doentes com outras doenças neurodegenerativas. Permite por isso um diagnóstico diferencial.

Doenças priónicas e proteína 14 -3 -3 A proteína 14 -3 -3 encontra-se nas células do SNC. As doenças dos priões ( CJD) levam à lesão cerebral aguda. Libertação da proteína 14 -3 -3 para o LCR. Detecção Sensibilidade 95% Especificidade 93% (do teste de diagnóstico) Não é possível na nv. CJD

Métodos de detecção de biomarcadores Libertação de proteína 14 -3 -3 Western blotting Autorradiografia Electroforese em gel poliacrilamida/SDS (SDS-page) Presença no LRC

Métodos de detecção de biomarcadores Western blotting Electroforese em Gel Massa, carga + Detecção por um anticorpo específico Marcação apenas da proteína de interesse

Bibliografia e Cibergrafia • http: //en. wikipedia. org/wiki/Biomarker_% 29% 28 medicine • http: //www. everythingbio. com/glos/definition. php? ID=3716 • http: //www. scielo. br/pdf/qn/v 30 n 5/a 46 v 30 n 5. pdf • http: //www. hcnet. usp. br/ipq/revista/vol 34/n 3/144. html • http: //www. medicalnewstoday. com/articles/137155. php • http: //adam. about. com/reports/000002_1. htm • http: //en. wikipedia. org/wiki/Tau_protein • http: //en. wikipedia. org/wiki/Beta_amyloid • http: //en. wikipedia. org/wiki/Alzheimer%27 s_disease