Factores que pueden modificar los resultados de los

Factores que pueden modificar los resultados de los estudios inmunohistoquímicos ¿Qué va a ser clave en la fase preanalítica? Aurora Astudillo, María Fernández Cimas , Rodrigo Ugalde Herra, Hospital Universitario Central de Asturias astudillo@hca. es

¿Dónde empieza y dónde termina la fase preanalítica en Patología? Q Isquemia A B Fijación Muestreado Procesado Seccionado Desenmascaramiento Descalcificación

Isquemia. ¿Fría o caliente? Temperatura Tiempo de isquemia Presión

Cómo influyen T, T y P sobre las proteínas, vamos a recordar… De entre las macromoléculas que componen nuestros tejidos y fluídos, los fundamentos de los estudios inmunohistoquímicos descansa en las proteínas Cuya estructura tridimensional, mantenida en las secciones histológicas hace que los anticuerpos que se diseñan reconozcan los epítopos de la fracción variable de aminoácidos contiguos en 3 D

Por lo que la conservación de la estructura de estas proteínas es esencial para ser reconocidas. Hay que recordar que la estructura 3 D está especialmente determinada por la carga de los AA Y que un número de ellos son hidrofóbicos. Las interacciones hidrofóbicas son las que más hacen por la estabilidad de la

A determinada temperatura, las proteínas se desnaturalizan desnaturalizacion La desnaturalización de una proteína despliega su estructura cuaternaria, terciaria y secundaria, pero no rompe la estructura primaria En algunos casos, la desnaturalización es reversible (renaturalización)

¿Cuál es la temperatura de desnaturalización de una proteína?

Desnaturalización de las proteínas La desnaturalización es la disrupción de la conformación nativa de la proteína El calor se usa comúnmente para desnaturalizar proteínas Temperatura de “melting”(Tm): el 50% está plegada y el 50% desplegada La Tm típica está entre 40 y 60º La Tm de las proteínas de las bacterias termófilas es de >100º (TAQ DNA Polimerasa) Hay agentes químicos desnaturalizantes (caotrópicos): urea, CNK, detergentes (SDS)

A los 80ºC, las proteínas se agregan y dificultan la reversibilidad de la desnaturalización. A 110º DESAPARECEN LOS RESIDUOS DE LOS AA El frío es también desnaturalizante

No sólo influye la temperatura, sino también la presión

CD 10, Vimentina,

Influencia de la descalcificación Bueno, feo y malo en un mismo producto: Ácido nítrico: compromete seriamente la inmunogenicidad, es bueno como fijador para combinado con formol marcar ganglios Acido fórmico: descalcificante, y en algunos casos, recuperación antigénica (a distintas concentraciones) EDTA: bueno pero lento (difícil que entre en el grupo…)

A la isquemia se pueden añadir Influencias derivadas de la condición del paciente tiempo de isquemia “caliente”

TUNEL

Qué efectos produce la isquemia en el tejido 1º daño oxidativo 2º Proteolisis 3º Cambio de Ph 4º liberación de calcio EN MEDIO DE Ph ácido, los residuos (-) de las proteínas se protonan, disminuyendo la estabilidad conformacional A nivel tisular y celular hay territorios más vulnerables que otros: A nivel celular también el daño varía: Membranas Mitocondrias ADN ARN Proteínas

¿Cómo repercute la isquemia en la Inmunohistoquímica? La isquemia prolongada produce marcaje inespecífico Interesante lo que ocurre en la necrosis. ¿Cómo valorarlo?

¿Cómo evitar la degradación de las proteínas? Fijad ores

Fijación Objetivo: Estabilizar las macromoléculas evitando su degradación Tipos de Fijación: física y química Deshidratación Enfriamiento Calentamiento Imbibición en un líquido fijador Líquidos fijadores Formol Fine. Fix y otros líquidos de base alcohólica Bouin Glutaraldehído…

Métodos de fijación y condicionantes Inmersión: requiere volumen 1/10, disección de muestras grandes y tiempo Microondas: tiene que tener un control de tiempo, periodicidad y w conocido Problema de someter al microondas tejido fijado de inmediato Solución: fijación en 2 tiempos

Mecanismo de acción de los fijadores, ¿Reversible o irreversible?

Alternativas: Finefix Ventajas: No toxicidad, no requiere precauciones en la inmersión, buena morfología, pendiente de validación en IHQ Inconvenientes: algo más caro, falta protocolización en marcadores moleculares Propuesta de grupos de trabajo

Otros condicionantes de la fase preanalítica: Procesado: tiempos, presión negativa, tipo de aclarantes Seccionado: espesor de los cortes Desenmascaramiento: Ph y temperatura

El desenmascaramiento renaturaliza las proteínas • Calor y Ph rompen los enlaces fuertes • Especialmente deshacen los entrecruzamientos con proteínas vecinas • Hasta el punto de poder rescatar las proteínas • Puede servir como control cuantitativo de referencia • Revisión del material antiguo archivado

Resumen y recomendaciones: • Conocer los porqués ayuda a tomar decisiones • El vacío permite prolongar tiempo de isquemia • Hay que controlar y documentar las etapas de la fase preanalítica, que debe formar parte de la información de la biopsia. • El formol todavía tiene recorrido: biomarcadores, test de farmacodiagnóstico

…. pero no nos quememos con el juego.