Extrao LquidoLquido Operao Unitria de transferncia de massa

Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas parcialmente solúveis ou insolúveis.

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS ELLBio Sistemas Poliméricos (PEG) de Duas Fases Aquosas (SPDFA) Sistemas Micelares Reversos Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA) Vantagens comuns aos 3 métodos • Rápidos • Baixo custo • Biocompatíveis (SMR)

Processo de separação de fases Sistema de duas fases Meio inicial: solução e/ou suspensão Fase Líquida Inicial - massa K= A FI AFII transferência de massa FP = R(%) = Ae(fase ext) Ae(inicial) AFI Ainicial . 100 Fase Líquida I (superior) Fase Líquida II (inferior)

separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases 1) Dois polímeros não-iônicos: PEG x Dextrana PEG x Polivinil álcool PPG x Dextrana Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana 2) Polieletrólito x Polímero não-iônico Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose

3) Dois polieletrólitos Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio 4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar PPG x fosfato de potássio PEG x fosfato de potássio metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio PPG x glicose PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio

Fase de fundo PEG x Dextrana PPG x Dextrana PEG x fosfato de potássio PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio • Rápida separação de fases • Baixo custo • Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade

Diagrama de fases: • ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de TOPO (PEG, por exemplo) • abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de FUNDO (Fosfato, por exemplo) • ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases • o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases em equilíbrio de uma série de sistemas • pontos acima da curva binodal: formação de duas fases • pontos abaixo da curva binodal: única fase Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema

Composição da fase PEG (%massa) Topo T Composição inicial M Linha de amarração ou “tie line” Curva binodal C B Ponto crítico Fosfato (%massa) Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato Composição da fase de Fundo

Linha de amarração sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final • A relação de volumes entre as fases varia composição de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM • Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO • Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO • C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.

VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA

Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de p. H Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de p. H

Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em p. H 8, 0

fórmula geral: HO-(CH 2)n-CH 2 OH. Massas molares: Prática: Abaixo de 1000 Daltons: líquido Soluções-Estoque 50% m/m Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos) Não se trabalha com volume devido à alta viscosidade

FATORES QUE INFLUENCIAM NO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) DE BIOMOLÉCULAS Interações Hidrofóbicas Cargas superficiais / p. H Diferença de Potencial Elétrico entre as Fases Efeito de “Salting-Out” da fase salina Diferenças de Viscosidade Diferenças de Densidade Interações Bioespecíficas Diagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex. ) Massa molar da biomolécula

Variáveis do processo Aspecto Ambiental 1 Concentração de Polímeros 2 Tipo e Concentração de Sal 3 Ligantes 4 Massa Molar do PEG 5 p. H 6 Temperatura 7 Tempo de Mistura e Separação Aspecto Estrutural 1 Resíduos hidrofóbicos 2 Massa molar da Biomolécula 3 Formato da biomolécula

Principais parâmetros para avaliação do processo Rtopo = rendimento na fase de topo (%) Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/m. L) Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração (g/L ou U/m. L)

PEG/Sodium Citrate células na interface PEG/Potassium Phosphate células no fundo Clarificação simultânea à purificação Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).

• Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente • Interações por afinidade: aumentam a partição - K Kaf • O ligante é ligado covalentemente ao polímero – em geral PEG • O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis • O ligante pode ser natural ou sintético formação do complexo polímero-ligante-biomolécula

• custo x benefício deve ser favorável • o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero • deve ser estável durante a imobilização • deve ser estável durante o processo de extração • não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula • não deve ser tóxico • disponível • fácil reversão da interação ligante/biomolécula.

Exemplos de material purificado por partição de afinidade Sistema Material purificado Ligante PEG/Dextrana -galactosidase APGP PEG/palmitato BSA e -lactalbumina Ácidos graxos PEG/fosfato Proteína A Ig. G humana PEG/fosfato Penicilina acilase Trimetilamina PEG/Dextrana Tripsina Inibidor de tripsina PEG/Dextrana Lipossomos Avidina Dext. /Hidropr opildextrana. Quimosina pepstatina PEG/Dextrana Módulos de carbohidrolases Domínios de ligação da celulose PEG/Dextrana Membranas da glândula lacrimal Aglutinina de trigo PEG/fosfato Amido Glicoamilase PEG/Dextrana Aglutinina de germe de trigo Membrana plasmática de fígado de rato PEG/Dextrana Ácidos graxos de cadeia entre C 2 à C 18 Albumina do soro humano, ßlactoglobulina, hemoglobulina, mioglobina PEG/Dextrana Ácidos graxos saturados de cadeia entre C 2 à C 18 e insaturados de 18: 1, 18: 2 e 18: 3, grupos acila e Benzoatos Albumina, lizozima, ribonuclease, α 2 - macroglobulina PEG/Dextrana Ig. G com fluído de ferro magnetizado Proteína A

Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.

Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes. Biomolécula Sistema Ligante acoplado ao PEG/ Dextrana Lactato desidrogenase Corante triazina Cibacron Blue F 3 G-A PEG/ fosfato Lactato desidrogenase Eudragit-Cibacron Blue PEG/ Dextrana Fosfofrutoquinase de levedura Cibacron Blue F 3 G-A-PEG PEG/ Dextrana Isoenzimas de fosfatase alcalina Procion Yellow H-E 3 G-PEG PEG/ Dextrana Fosfoglicerato quinase Cibacron Blue-PEG PEG/ Dextrana Formato desidrogenase Cibacron Blue-PEG PEG/ fosfato Xilose redutase Drimaren

Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções: 1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa 2. Separar os dois líquidos após a extração

Equipamento por estágios • Misturador – decantador* • Misturador – decantador em cascata vertical Equipamentos de contato diferencial • Coluna de extração spray* • Coluna de extração com recheio • Extrator de discos rotativos perfurados • Extrator Graesser

Esquema de um misturador-decantador.

Equipamentos centrífugos Mais importante: extrator Podbielniak Tambor cilíndrico com placas concêntricas Fase pesada é alimentada próximo ao centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada próximo à periferia do extrator Escoamento contra-corrente

Desenho esquemático de um extrator Podbielniak.

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