Expresso Recombinante em Clulas Eucariticas 1 Introduo 2

Expressão Recombinante em Células Eucarióticas 1 -Introdução 2 -Sistemas de expressão em leveduras Edmar Vaz de Andrade

1 -introduçao Dificuldades em sistemas de expressão em Escherichia coli 1 -Processamento pós-traducional da proteína (glicosilação) 2 -Enovelamento da proteína na conformação nativa (corpos de inclusão) 3 -Degradação da proteína recombinante pela E. coli.

2 -Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae Fácil manipulação Cultivo relativamente rápido preservam as características favoráveis das bactérias Maior proximidade filogenética de animais do que as bactérias processamento pós-traducional comparável ao dos eucariotos pluricelulares

2 -Sistemas de expressão leveduras Padrão de Glicosilação

2 -Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris Alto rendimento de proteína recombinante Glicosilação comparável à realizada em células animais Maior eficiência de secreção

2 -Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Terminador de transcrição Promotor álcooloxidase Gene Amp. R Peptídeo sinal Gene selvagem para biossíntese de histidina Origem de replicação em E. coli INVITROGEN

2 -Sistemas de expressão leveduras Transformação de leveduras P. pastoris HIS 4 Recombinação Homóloga INVITROGEN

2 -Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Marca auxotrófica (nutricional) para biossíntese de histidina Cultivo em meio de cultura sem histidina Clones não transformados são inviáveis

2 -Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Indução da síntese de proteína recombinante com adição de metanol como fonte de carbono Para inibir o promotor: cultivo na presença de glicerol como fonte de carbono Obtenção da proteína solúvel no sobrenadante