Expresso Gnica Marclio C P de Souto DIMApUFRN

Expressão Gênica Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN

Expressão Gênica n n n Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (=transcrição & tradução) A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas)

Expressão Gênica n . . . então os genes interagem em redes complexas: n n Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta (upregulates) A, . . . Assim, perturbações em um único gene podem levar a mudanças na expressão de vários genes

Para que estudar Expressão Gênica ? n n As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar uma doença

Genômica Funcional n O próximo passo após o sequenciamento: n n Passo complexo n n Proteínas e genes interagem em redes altamente conectadas Tradicionalmente a biologia molecular vem trabalhando baseada no paradigma n n Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e características fenotípicas do organismo Um gene, uma função No entanto, . . .

Microarrays n n n . . . microarray podem medir a expressão de vários genes ao mesmo tempo Microarrays são em geral lâminas de vidro com uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas Um spot contém milhões de moléculas de DNA idênticas ou oligonucleotídeos (sondas) n n As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais como c. DNA de um gene O microarray pode conter milhares de spots n Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano

Experimentos com Microarrays n Quase todo m. RNA n n n m. RNA da célula ~ genes expressos c. DNA Utiliza-se c. DNA, que é mais estável Rotule c. DNA das células de referência de verde (Cy 3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy 5) n n proteína Triture células e extraia o m. RNA Faça a transcrição reversa RNA n n traduzido P. Ex. : Cy 3=Célula Normal Cy 5=Célula Cancerosa Hibridize ambas as amostras, células referência e alvo, em um único microarray

Fabricação do Array (1/4) Seleção das sondas (c. DNA) a serem impressas no array Três dos milhares de c. DNA conhecidos relevantes para a questão biológica investigada Obtidos de bibliotecas de c. DNA Ou feitos a partir de amostras de m. RNA

Fabricação do Array (2/4) Amplificação por PCR

Fabricação do Array (3/4) c. DNAs são imobilizados em pontos específicos no substrato

Fabricação do Array (4/4) Spot contendo várias cópias de c. DNA (sondas) de um gene específico

Preparação da Amostra de células de referência ou controle (RNA controle) Amostra de células a ser analisada (RNA experimental) AA AAAAAAA A 5’ 5’ 5’ AA A Obs: Também pode ser realizados experimentos sem a amostra de controle e também para se comparar duas amostras de interesse Extrai RNAm A 5’ 5’ 5’ AAAA A 5’ AA AA AA

Síntese e Rotulação de c. DNA (1/3) Primer TTTTT Transcriptase reversa d. NTP 5’ 5’ 5’ AAAAA TTTTT Fita de c. DNA é sintetizada Cada amostra é marcada com um corante diferente

Síntese e Rotulação de c. DNA (2/3) 5’ 5’ AAAAA TTTTT m. RNA é degradado

Síntese e Rotulação de c. DNA (2/3) DNA polimerase 5’ 5’ TTTTT Segunda fita do c. DNA é sintetizada

Síntese e Rotulação de c. DNA (2/3) 5’ 5’ 5’ TTTTT c. DNA é desnaturado

Síntese e Rotulação de c. DNA (3/3)

Hibridização Amostra sob investigação Microarray (1/3) Amostra é colocada no array para hibridização

Hibridização (2/3)

Hibridização (3/3) Lava o excesso de c. DNA das amostras rotuladas

Scanning (1/3) Scanner

Scanning (2/3) Software do scanner sobrepõe imagens

Scanning (3/3) Software do scanner sobrepõe imagens

Experimentos com Microarrays Resultados n O spot para o gene 1 = n n n Vermelho se há mais m. RNA 1 nas células de teste Verde se há mais m. RNA 1 nas células de referência Amarelo se são iguais Preto se o gene não foi expresso Dados em geral expressos na forma de uma matriz de níveis de expressão relativa intensidade vermelha intensidade verde indexada pelos genes e as amostras das células de teste

Esquema de um microarray

Dados de Microarray Característica g 1 g 2 Padrão 1 Padrão 2 g. N-1 g. N Classe Câncer Normal Padrão 3 Padrão i Padrão m Câncer

Como é feita a análise ? n Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-se chegar a conclusões sobre a expressão gênica num determinado estado fisiológico

Algumas Aplicações n n n n Descoberta de genes Determinar quais genes estão sendo expressos em um determinado tipo de célula em um dado momento e sob certas condições Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido doente) Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião Análise da regulação gênica Identificação de doenças genéticas complexas Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia Detecção de mutação/polimorfismo

Outras Tecnologias n As técnicas de AM a serem descritas também podem ser aplicadas a dados de expressão gerados com outras tecnologias n MPSS (Massively Parallel Signature Sequence technology) n n SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) n n Brenner et al. , 2000 Velculescu et al. , 1995 Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) n Freeman et al. , 1999