Exploration des rponses immunitaires ED L 3 Fvrier

Exploration des réponses immunitaires ED L 3 Février 2018

Réponse immunitaire Microbes Bactéries, virus parasites, champignons Immunité Innée Immunité adaptative Complément CD 4 CD 8 Lymphocytes T Macrophage Cellulaire Tissus Lymphocyte B Polynucléaire N Cellule Dendritique Monocyte NK Agression Plaie, effraction Inflammation Périphérie Humorale Plasmocyte Phagocytose Migration Organes lymphoïdes Ganglion

Immunité Innée/adaptative

Hémogramme Leucocytes 4 000 - 10 000/mm 3 Polynucléaires neutrophiles Polynucléaires éosinophiles Polynucléaires basophiles 1 700 - 7 000 50 - 500 0 – 50 Immunité innée Lymphocytes 1 500 - 4 000 Immunité adaptative 100 - 1000 Immunité innée Monocytes

Immunité innée Barrière cutanéo-muqueuse Substance bactéricide, p. H Phagocytes: PNN, monocyte NFS Cellules NK Immunophénotypage Cellules dendritiques Système du complément Cytokines (interféron) Exploration du complément

Immunité Innée: exploration du complément Voie classique Voie alterne Voie des lectines Mesure fonctionnelle: CH 50 Complexe d’attaque membranaire Mesure protéine du complément: - C 3 - C 4

Immunité Innée: exploration du complément Mesure fonctionnelle: CH 50 GR de mouton + Ac anti GR de mouton + Sérum du sujet GR de lapin + Sérum du sujet Voie classique Voie Alterne Activation du complexe terminal Lyse du GR Mesure de l’Hb libérée Augmentation: processus inflammatoire Diminution: consommation, déficit DO 50%

Cellule NK CD 2 CD 16 CD 56 CMH I Récepteurs Inhibiteurs CMH II Cellule NK <+ CD 25 NK activée CMH I Récepteurs activateurs Cellule modifiée tuée Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifique des molécules distribuées sélectivement sur les NK). Exploration fonctionnelle (cytolyse). Cellule Tumorale Ou infectée

Immunité innée: cellules NK Etude en cytométrie en flux: CD 3 - CD 56+ (quantitative)

Immunité innée: cellules NK Etude fonctionnelle Mesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif Marquer les cellules cibles avec du Na 251 Cr. O 4 Ajouter les cellules NK (ou T cytotoxiques) aux cellules cibles marquées Les cellules tuées libèrent Du chrome radioactif Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites

Immunité adaptative Ontogenèse lymphocytes T et B

Immunité adaptative • NFS Lymphocyte B production Ac Lymphocyte T prolifération cytotoxicité • Cytométrie en flux – Phénotypage lymphocytaire T et B – Marqueurs d’activation lymphocytaire – Marqueurs cellules naïves/cellules mémoires • Tests fonctionnels – – Prolifération Production de cytokines Test de cytotoxicité Production d’anticorps

Immunité adaptative: cytométrie en flux

Immunité adaptative: cytométrie en flux • Lymphocytes T: CD 3+: 50 - 80% 900 – 3000/mm 3 • Ly T 4: CD 3+ CD 4+: 32 - 52% 450 – 1500/mm 3 • Ly T 8: CD 3+ CD 8+: 20 – 40% 300 – 1000/mm 3 • Lymphocytes B: CD 19+: 5 – 20% 100 – 450/mm 3

Isolement des lymphocytes - gradient de densité - récupération d’un anneau cellulaire contenant lymphocytes et monocytes Cellules mononuclées GR, PNN Centrifugation sur un milieu de séparation de densité Ficoll-Hypaque

Exploration immunité humorale • Cytométrie en flux: • nombre de LB • marqueur de différenciation • LB naïfs: CD 27 -/ Ig. M+/ Ig. D+ • LB mémoire avant commutation: CD 27+/Ig. M+/Ig. D+ • LB mémoire après commutation: CD 27+/Ig. M-/Ig. D- In vitro • Prolifération • Etude production d’anticorps • EPP • Dosage des Ig • Réponse vaccinale In vivo

Exploration immunité humorale in vitro Dosage des gammaglobulines Dosage des classes d’Ig: - Ig. G 6. 6 -12. 8 - Ig. A 0. 7 -3. 4 - Ig. M 0. 5 -2. 1 Dosage des sous-classes d’Ig: - Ig. G 1 3 -12. 8 - Ig. G 2 0. 4 -6. 3 - Ig. G 3 0. 12 -1. 14 - Ig. G 4

Exploration immunité humorale in vivo Réponse vaccinale: Sérologies pré et post vaccinales • Diphtérie • Tétanos • Pneumocoque • Haemophilus

Immunité adaptative: cellulaire • Cytométrie en flux: • phénotypage lymphocytaire T: CD 3, CD 4, CD 8 • marqueurs d’activation lymphocytaire: HLA-DR • marqueur de différenciation • LT naïfs: CD 45 RA+/CD 62 L+ • LT central mémoire: CD 45 RA- ou RO+/CD 62 L+ • LT effecteur mémoire: CD 45 RA- ou RO+/CD 62 L • LT revertant: CD 45 RA+ ou RO-/CD 62 L- In vitro • Prolifération • Production de cytokine • Elisa • Elispot • Test de cytotoxicité • Test d’hypersensibilité retardée In vivo

Exploration immunité cellulaire: prolifération • Activateurs non spécifiques: mitogènes polyclonaux • phytohémagglutinine ou PHA: lymphocytes T • Concanavaline ou Con. A: lymphocytes T • pokeweed mitogen ou PWM: lymphocytes T (et B) Induisent la mitose de beaucoup de Ly de spécificité différente = prolifération polyclonale • Activateurs spécifiques • Antigène de vaccination: tuberculine, anatoxine tétanique • Antigène de l’environnement: streptocoque, CMV

Exploration immunité cellulaire: prolifération Mesure de la prolifération par incorporation de thymidine tritiée 3 TH (radioactive) Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à sujets sains témoins

Exploration immunité cellulaire: prolifération Mesure de la prolifération en cytométrie en flux après marquage au CFSE: marqueur fluorescent, rentre dans le cytoplasme A chaque division cellulaire, la fluorescence diminue de moitié dans chaque cellule fille

Cytokines: orientation de la réponse immunitaire cellulaire Immunité Innée Orientation de la réponse immunitaire

Cytokines: orientation de la réponse immunitaire cellulaire Polarisation de la réponse T T-bet STAT-4 IL 12 IL 4 IFN Cellulaire (pathogènes à x Intracellulaire TH 1 Humorale GATA-3 STAT-6 IL 4 (pathogènes à x Extracellulaire TH 2 T CD 4 Naïf Thymocyte TGFb 1 IL 6 TGFb 1 RORg. T STAT-3 IL 17 Neutrophile (pathogènes à x Extracellulaire TH 17 Fox. P 3 Treg TGFb 1 Régulation Négative

Exploration immunité cellulaire Mesure production de cytokines par cellules immunitaires Activation des cellules en culture non spécifique / spécifique Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h - Dosage Immunoenzymatique - Dosage Cytométrie en flux Quantification des cellules CD 4+/CD 8+ productrices - Cytométrie en flux - ELISPOT

Exploration immunité cellulaire Production de cytokines Activation de cellules en culture (non spécifique ou spécifique) Récolte du surnageant de culture après 24 -48 h Dosage ELISA ou en CMF

Exploration immunité cellulaire Production de cytokine: ELISPOT Quantification des cellules T productrices d’IFN après stimulation - par des peptides de 9 aa réponse des LT CD 8+ spécifiques - par des Ag ou des peptides de 20 aa réponse des LT CD 4+ spécifiques Peptides ou antigène substrat jaune PAL Y Y Y PAL Y IFN violet Y Y Y

Exemple du Quantiféron

Exploration immunité cellulaire Hypersensibilité retardée Exemple du test à la tuberculine Injection intra-dermique de tuberculine (extrait de Mycobactérium tuberculosis) Immunité à médiation cellulaire Réponse locale (papule rouge indurée) à lire 72 h après: <5 mm: réaction négative: pas de contact antérieur avec BK ou BCG déficit immunitaire si contact antérieur >5 mm: réaction positive: contact antérieur phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection Histologie: lymphocytes T et nombreux monocytes/macrophages

Immunité adaptative: cellulaire Hypersensibilité retardée Exemple du test à la tuberculine Traduction histologique: granulome présence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages