Experiment Test na ptomnost patogenu ve vod z

Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR

Vodu z mytí brambor použijeme k naočkování LB (Luria-Bertani) media. Další testy budeme provádět s izolovanými koloniemi, které se na tomto médiu objeví.

1. Extrakce DNA

1. 1. Pipetujte 50μL sterilní destilované vody do sterilní mikrozkumavky (P 1) 1. 2. Kalibrovanou 1μL sterilní kličkou odeberte bakteriální kulturu 1. 3. V mikrozkumavce (P 1) rozmíchejte bakteriální materiál – vytvořte suspenzi Pozor! Suspenze musí být homogenní!

1. 4. Inkubujte mikrozkumavku (P 1) do vodní lázně při 100°C na 1 minutu. 1. 5. Vložte mikrozkumavku (P 1) do centrifugy. 1. 6. Odstřeďujte mikrozkumavku (P 1) po dobu 5 minut při 4500 otáčkách za min. 1. 7. Vyjměte zkumavku a přeneste supernatant s DNA do další sterilní mikrozkumavky (P 2).

2. Příprava směsi pro PCR (M)

2. 1. Do sterilní mikrozkumavky pipetujte: 90 µL sterilní destilované vody Ø 50 µL pufru 10 X Ø 28 µL Mg. Cl 2 25 m. M Ø 28 µL d. NTP 0, 2µM Ø 4 µL Taq polymerázy 2. 2. Pokud PCR neprovádíte během dne přípravy směsi, je nutné směs zmrazit! 2. 3. Před použitím rozmrazte a krátce odstřeďte. ! směs pro PCR je již připravena !

3. Amplifikace DNA

3. 1. Do mikrozkumavky (A) pro PCR pipetujte 10µL roztoku DNA z mikrouzkumavky (P 2). 3. 2. Přidejte 20µL PCR mix (M). 3. 3. Přidejte 10µL každého primeru metk. RPECTO a metk. FPECTO nebo 16 SR a 16 SF. Promíchejte svůj roztok opakovaným pipetováním a vypouštěním! Je možné použít oba páry primerů současně. Objemy primerů jsou potom 5μL.

3. 4. Mikrozkumavku (A) krátce odstřeďte. 3. 5. Vložte mikrozkumavku (A) do termocykleru. T°C Nb cycles Poznačte si její umístění!

Kontrola amplifikace DNA 3. 6. Připravte dva kontrolní vzorky – zopakujte kroky 3. 1. až 3. 5. , přitom nahraďte roztok DNA (P 2): Ø Vodou pro negativní kontrolu (C-) Ø Roztokem DNA Pectobacterium atrosepticum pro pozitivní kontrolu (C+)

3. 7. Nastavte termocykler : 96°C, 5 min 40 cyklů : • 94°C, 30 s • 58°C, 30 s • 72°C, 50 s 5`, 96°C denaturace 72°C 5 min Skladujte při 4°C 30``, 94 ° denaturace 40 cyklů 30``, 58°C navázání 5`, 72 °C dokončení 30``, 72 °C elongace 3. 8. Spusťte amplifikaci. T°C Nb cycles

4. Electroforéza fragmentů DNA

4. 1. Do tří sterilních mikrozkumavek (E 1, E 2, E 3), pipetujte 10μL roztoku PCR (A, C-, C +). 4. 2. Přidejte 2μL nanášecího pufru (X) a zamíchejte.

4. 3. Z gelové kazety odstraňte ochranný obal. 4. 4. Vypláchněte jamky demineralizovanou vodou. Nakloňte kazetu – vylijte přebytečnou tekutinu a kazetu opatrně vysušte.

4. 5. E 1. Do jamky pipetujte 5 µL testovaného roztoku 4. 6. Do vedlejších dvou jamek potom 5 µL kontrolních roztoků E 2 a E 3. 4. 7. Do čtvrté jamky pipetujte 5µL roztoku molekulárních markerů (W)

4. 8. Spusťte elektroforézu a nechejte ji probíhat po dobu 10 min při 220 V. 4. 9. Vypněte zařízení v okamžiku, kdy první proužky roztoku molekulárních markerů doputují na konec gelu.

5. Analyzujte vaše výsledky