Examens complmentaires en hmatologie En pratique F hmatologie

Examens complémentaires en hématologie En pratique F hématologie cellulaire F hémostase

Examens complémentaires en hématologie F hémogramme F numération des réticulocytes F fer sérique, transferrine et ferritine F électrophorèse de l’Hb, test de Coombs, dosages vitaminiques F méthodes isotopiques in vivo F immunophénotypage des cell. Sanguines F myélogramme/biopsie médullaire F adénogramme/biopsie ganglionnnaire F caryotype/réarrangement des gènes des Ig et du TCR /recherche de translocations en biologie moléculaire

Examens complémentaires en hématologie F Quand? hémogramme bilan systématique -pré-opératoire -1ère hospitalisation Bilan orienté - pâleur, dyspnée, amaigrissement, fièvre inexpliquée, adénopathies, VS… F Comment? prélèvement: veineux, jeun non obligatoire ne pas prélever dans tubulure de perfusion (dilution), à distance des intra-lipides (interférence avec leucocytes) à adresser à t°ambiante en – de 6 H F Conditions de réponse: fonction de l’urgence clinique, distance du laboratoire, horaire des ramassages… 20 mn à 6 H

Examens complémentaires en hématologie hémogramme F Technique : automates utilisant 2 paramètres principaux comptage électronique des particules, diffraction d’un rayon laser à petit et grand angles (volume, densité du contenu de la cellule èGR hypo/hyperchromes), +/- techniques cytochimiques (évaluation du contenu en peroxydases des granuleux et monocytes) +/- techniques de fluorescence (densité du noyau, contenu en ARN du cytoplasme ex lymphocytes activés) F Systèmes d’alarmes de + en + précises quanti/qualitatives détectant les incertitudes de l‘automate les microcytes peuvent être comptés comme des plaquettes les grosses plaquettes comme des leucocytes GR décomptés comme leucocytes ds certaines conditions gouttelettes lipidiques décomptées comme des GB

Examens complémentaires en hématologie hémogramme F valeurs automatisées -mesurées (réponse dans 1/2 journée): ü numération des GR, des GB et des plaquettes ü taux d’hémoglobine ü volume globulaire moyen et indice de distribution (CVGR<15%) - calculées: TGMH* (Hb/nbre GR) *TCMH ou HCM mesurée particule/particule è% GR hypochromes hématocrite ( GRx. VGM)- CCMH (Hb/Ht) pas d ’intérêt clinique ü formule leucocytaire en valeur absolue - 5 catégories leucocytaires Gr N, Eo, B; Ly; Monocytes - détection de cellules anormales +/- fiable ss forme d’alarmes F toute anomalie quantitative/qualitative détectée par l’automate génère des alarmes è étude morphologique des éléments figurés sur lame èréponse dans journée

Examens complémentaires en hématologie hémogramme étude morphologique des éléments figurés sur lame ü étalement automatisé ou manuel d ’une goutte de sang et coloration de MGG ü décompte de 100 leucocytes F morphologie des GR, détection d’érythroblastes à décompter du nombre de GB si nombreux (comptés par plupart des automates comme GB) F morphologie des leucocytes et détection des cellules anormales (myélémie, blastes, cellules lymphomateuses. . ) F morphologie plaquettaire et détection d’éventuels agrégats plaquettaires (fausses thrombopénies) F sur certains automates, détection automatisée des érythroblastes et de la myélémie

Examens complémentaires en hématologie hémogramme Numération globulaire normale en fonction de l ’âge et du sexe Homme Femme Enfant Nourrisson 3 -12 ans 3 mois-1 an Nouveau-né Nombre de GR 1012/l 4. 5 -5. 8 4 -5. 4 3. 6 -5. 5 3. 2 -4. 2 3. 9 -5. 5 Hb (g/dl) 13 -18 12. 16 11 -15 10 -12. 5 13. 5 -19. 5 VGM (fl) 83 -98 76 -93 72 -85 98 -118 TGMH (pg) 27 -32 24 -32 25 -34 30 -36 Hématocrite (l/l) 40 -54 35 -47 36 -44 30 -41 42 -62 CCMH (g/dl) 32 -36 32 -36 Nombre de GB 109/l 4 -10 4. 5 -12 6 -17 10 -25 neutrophiles 1. 8 -7 1. 5 -8 1 -8. 7 6 -25 éosinophiles 0. 05 -0. 5 0. 05 -0. 7 0. 05 -0. 6 basophiles 0 -0. 05 lymphocytes 1. 5 -4 1. 5 -6. 5 3. 5 -16 2 -15 monocytes 0. 1 -0. 9 0. 1 -0. 6 0. 1 -0. 8 0. 1 -1. 5 Plaquettes 109/l 150 -500 150 -450 150 -600

Examens complémentaires en hématologie Anomalies des Globules rouges F valeurs automatisées : -numération des GR -taux d’hémoglobine Anémie Hb <11 - 13 g/dl Polyglobulie Hb >16 -18 g/dl fausses anémies par hémodilution (grossesse, splénomégalie, composant monoclonal Ig. M très élevé) fausses polyglobulies par hémoconcentration (grands brûlés) anémies masquées par hémoconcentration (déshydratation) -volume globulaire Microcytaire <80 fl normo/macrocytaire 82 -140 fl CVGR >15% distribution anormale du volume des Gr -TGMH calculé Hypochrome<27 pg Normochrome 27 -33 * TCMH ou HCM mesurée particule/particule è % de GR hypochromes è détection précoce d’une carence en fer avant modification de la valeur moyenne globale

Examens complémentaires en hématologie Anomalies leucocytaires et plaquettaires F Neutropénie en valeur absolue < 1. 8 G/L ou 109/l - sévère si < 1 - agranulocytose si < 0. 5 (urgence diagnostique) Polynucléoses > 8 +/- myélémie (+/- importante) F Hyperlymphocytoses > 4 G/L ou 109/l - réactionnelles - tumorales Cytologie +/- phénotype à confronter à l ’âge, contexte clinique (fièvre, syndrome tumoral) F Hyperéosinophilies > 0. 9 G/L ou 109/l F thrombopénie < 150, sévère si < 50, symptomatique si < 20 F hyperplaquettose > 600 causes multiples, > 1000 SD myéloprolifératif

Examens complémentaires en hématologie Numération des réticulocytes Quand? devant anémie normo/macrocytaire Évalue la production médullaire érythroblastique et donc le caractère régénératif ou arégénératif de l’anémie Comment? Détection de l ’ARN ribosomial des GR immatures (48 H à 72 H) F classiquement par bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène avec lecture au microscope sur 1000 GR F actuellement détection automatisée par produits fluorescents technique plus rapide et précise è% et niveau de fluorescence Valeur si < 25 x 109/l èérythropoïèse défaillante (insuff médullaire primitive ou secondaire: insuff rénale, cause endocrinienne, carences vitaminiques, envahissements) si > 110 x 109/l è érythropoïèse augmentée (anémie régénérative : hémolyse, hémorragie aigüe)

Examens complémentaires en hématologie Exploration du fer Quand? ü devant une anémie hypochrome microcytaire, avant traitement. pour le dosage du fer arrêt de Tt par le fer depuis 72 H, prélèvement soigneux à jeun évitant l’hémolyse, A Savoir Ä causes principales des anémies hypochromes : carence martiale +++ thalassémie hétérozygotte +++ anémie inflammatoire +/Ä suspecter la carence en fer avant l’anémie devant une hypochromie isolée, 1ère anomalie de la NF diminution des capacités physiques à l’effort baisse des capacités intellectuelles moins bonne résistance aux infections ü si suspicion de surcharge martiale

Examens complémentaires en hématologie Exploration du fer Comment? Dosages -fer sérique, transferrine et/ou ferritine Dosage: fer sérique (13 -20µmol/l), transferrine (2 -3. 8 g/l), et CTF 45 -70µmol/L, ferritine (30 -400 µg/l chez homme, 20 -300 chez femme) Calcul du coefficient de saturation (CS) de la transferrine (N = 30%) interprétation d’une hyposidérémie si carence en fer: fer sériqueî CTF transferrineì CSî ferritineî si sd inflammatoire: fer sériqueî CTF transferrineî CS N ferritineì Limites ferritine: ì dans lyses cellulaires importantes, difficile à interpréter si association carence et sd inflammatoire - Récepteur soluble de la transferrine, ì en cas de carence en fer et non influencé par Sd inflammatoire - dosage de l’ hepcidine dans l’avenir? Hormone régulant l’absorption intestinale du fer et son relargage par les macrophages, hyperproduction dans l’anémie inflammatoire

Examens complémentaires en hématologie Dosages vitaminiques Quand ? devant une anémie macrocytaire avant tout traitement et toute transfusion, après le myélogramme À savoir: Possibilité d’association carence vitaminique/hémopathie carence vitaminique probable si VGM > 120 fl. pas d‘urgence à traiter (anémies d’installation chronique) Comment? Dosages vitamine B 12 (200 -500 pg/ml) et folates sériques (5 -15 ng/ml), érythrocytaires (>200 pg/ml de GR) par technique de radio-analyse Test de Coombs Quand? Devant une anémie normo/macrocytaire régénérative (réticulocytes > 120 x 109/l ), pour recher origine auto-immune Comment? sur sang veineux; Test direct: mise en évidence d’anticorps fixés sur les GR du patient, en ajoutant des anticorps de lapin antiimmunoglobulines humains : si test +, agglutination des GR test indirect: recherche d’AC libres dans le sérum du patient en présence d’un panel de GR portant des antigènes connus, si fixation, agglutination en ajoutant du sérum de lapin anti-Ig humaines.

Examens complémentaires en hématologie Electrophorèse de l’hémoglobine Quand ? ü quand on suspecte une anomalie de l’hémoglobine de srtucture ou de synthèse En particulier devant une anémie hypochrome microcytaire , avec CVGR normal (si ìCVGR è carence en fer) et fer sérique et ferritine normal ou augmenté Comment? Sang veineux, étude de la migration des hémoglobines dans un champ électrique Normales: Hb A 1 prédominante, Hb A 2 < 3. 5%, Hb F traces

Examens complémentaires en hématologie Méthodes isotopiques in vivo F masse sanguine quantification précise du volume globulaire par technique de dilution d’hématies du sujet marquées au Cr 51 ou Te 99 du volume plasmatique par albumine marquée indications Trancher entre polyglobulie vraie et fausse polyglobulie (î du volume plasmatique), anémie vraie et par hémo-dilution Ftest de Schilling étude de l’absorption de la vitamine B 12 marquée au Co 58 donnée per os, après saturation des réserves hépatiques avec B 12 froide, par élimination urinaire en 48 H. étude du mécanisme du défaut d’absorption par ingestion de B 12 marquée par un autre isotope du Co associée à du FI

Examens complémentaires en hématologie immunophénotypage Quand? Caractérisation de cellules anormales dans le sang, moëlle osseuse, ganglion, liquides…. , pour préciser la filiation et le niveau de différenciation cellulaire, recher une clonalité B et/ou un profil spécifique d’une entité donnée Comment? Mise en évidence d’antigènes membranaires ou cytoplasmiques spécifiques de lignée et/ou de différenciation cellulaire, sur sang total ou suspensions cellulaires, par techniques d’immunofluorescence et lecture en cytométrie de flux ou d’immunocytochimie En pratique: technique assez longue (1 à 3 H), semi-manuelle et coûteuse indications à discuter avec le biologiste (en dehors des numérations CD 4/CD 8) Adresser des tubes de sang sur EDTA (tubes à NFP) sur RV

Cytométrie de flux F Rapide (1 à qques H) F Clonalité B (restriction isotypique de l’expression des chaînes légères) F caractérisation précise des pop. tumorales par doubles, triples et quadruples marquages è profils spécifiques (entités B) è phénotypes anormaux (T>>B) F Quantification de marqueurs Faible consommation cell. Corrélation marqueur/cellule Réalisation compatible avec urgence (1 H avec kits commerciaux) Immunocytochimie CD 10

Indications préférentielles Cytométrie de flux F Sang total, Moëlle totale, liquides, suspensions cellulaires à partir de tissus Etalements directs (adénogrammes, myélogrammes, empreintes de biopsies. . ) Étalements cyto-centrifugés de suspensions Immunocytochimie CD 10

Examens complémentaires en hématologie immunophénotypage Antigènes de la lignée T : CD 2, CD 3, CD 5, CD 4, CD 8 Antigènes de la lignée B: DR, CD 19, CD 20, CD 79, immunoglobuline Antigènes des cellules myéloïdes: CD 13, CD 33, myéloperoxydase Antigènes des cellules monocytaires CD 14, CD 11 Antigènes des cellules érythroïdes: glycophorine A Antigènes de la lignée plaquettaire : CD 41, CD 42 Antigènes des cellules immatures : CD 34, CD 117 Profils phénotypiques spécifiques : Leucémie lymphoïde chronique CD 19+ CD 5+ CD 23+ Lymphome folliculaire CD 20+ CD 10+ CD 5 -

Examens complémentaires en hématologie Explorations tissulaires Recommandations générales F pour un diagnostic précis, rapide, économique nécessité d’une synergie clinico-biologique - donner des renseignements sur tableau clinique, antécédents familiaux et personnels, traitements éventuels - préciser si possible ce que vous attendez de l ’analyse demandée - s’informer sur modalités de prélèvement - prélever avant tout traitement - ne pas hésiter à prendre contact avec le laboratoire

Examens complémentaires en hématologie myélogramme Quand? è Recher/éliminer une hémopathie - cytopénie(s): anémie normo/macrocytaire arégénérative, neutropénie sévère, thrombopénie - hyperleucocytose, thrombocytose en dehors sd inflammatoire /infectieux - polyglobulie vraie (masse sanguine ì) è bilan d’extension d’un lymphome è recherche d’une métastase è bilan d’un composant monoclonal sérique/urinaire è bilan de fièvre prolongée, baisse de l’EG, VS augmentée sans cause infectieuse

Examens complémentaires en hématologie Comment? myélogramme Ponction sternale sauf intervention chir. ou irradiation complications exceptionnelles (effraction crosse aortique), crête iliaque postérieure (moins dangereux) trocard à usage unique type Mallarmé avec garde, anesthésie locale peau +/-périoste (patch d’EMLA si hospitalisation, 30 mn de délai, xylocaïne en injection s/c) Technique: Traverser table externe du sternum (pression douce si sujet âgé), puis aspiration intense et brève (douloureuse) de 1 cc de moëlle maximum dans une seringue de 10 cc Recueillir le maximum de grains et les écraser entre 2 lames, Éventuellement 2ème aspiration pour caryotype, culture de progéniteurs hématopoïétiques, myéloculture

Examens complémentaires en hématologie myélogramme En pratique Laisser sécher les frottis à l’air, les adresser au laboratoire avec fiche de renseignements remplie soigneusement Examen des lames après coloration de May-Grünwald-Giemsa (2045 mn), délai moyen de réponse écrite 48 H, réponse orale si urgence (pour mise en route de traitement) en 2 H (après l’arrivée au laboratoire!) Examens complémentaires (décidés par le biologiste) cytochimiques Présence et répartition du fer (coloration de Perls) recherche d’enzymes utiles au diagnostic des hémopathies Immunocytochimiques mise en évidence d’antigènes de surface/cytoplasmiques pour caractériser des cellules métastatiques/blastiques/lymphoïdes anormales Limites du myélogramme: moëlle hypoplasique ou avec fibrose Pas de contre-indication

Examens complémentaires en hématologie Biopsie de moëlle Quand? En deuxième ligne après réalisation du myélogramme sauf - bilan d’extension d’un lymphome ou d’un carcinome, - si suspicion de myélofibrose à l’hémogramme (hématies en poire, érythroblasto-myélémie) Comment? - Asepsie +++ - préparation morphine + patch d’EMLA + AL à la xylocaïne -Prélèvement d’un cylindre osseux sous anesthésie locale soigneuse à l’aide d’un trocard de Jamshidi à usage unique, enfoncé sur une longueur de 1. 5 à 2 cm en crête iliaque postéro-supérieure (crête iliaque antérieure si obésité ++) - Après extraction de la carotte, réaliser des empreintes sur lames, puis placer l’échantillon dans un liquide de fixation formolé. Contre-indication absolue: traitement par anti-vitamines donc relais AVK par Héparine de bas poids moléculaire

Examens complémentaires en hématologie Biopsie de moëlle Résultat minimum de 72 H pour avoir le résultat. Renseigne sur : F richesse et structure du tissu myéloïde (différenciant hypoplasie et fibrose, les 2 pouvant entraîner un échec du myélogramme) F présence et quantité de cellules anormales, par rapport au myélogramme - meilleure évaluation quantitative, voire détection surtout si foyers fibreux (lymphome, métastase) - moins bonne définition cellulaire donc moins bonne catégorisation des cellules anormales Myélogramme et BM complémentaires et non substitutifs

Examens complémentaires en hématologie Ponction ganglionnaire (adénogramme) Quand? Bilan d’une adénopathie isolée ou polyadénopathie Comment? Geste peu douloureux et facile à réaliser Prélèvement de suc ganglionnaire, par aiguille de taille petite /moyenne, avec /sans aspiration, après immobilisation du ganglion entre 2 doigts, puis projection sur 1 ou plusieurs lames de verre et étalement très doux* et séchage à l’air. Si aspect purulent, renouveler l’aspiration pour étude bactériologique, avec aiguille plus grosse si pus épais. Si échec, renouveler avec aiguille plus grosse. Résultat coloration de MGG (idem myélogramme) délai moyen 48 H. Réponse orale si urgence en 2 H. F rassure si aspect inflammatoire banal, concordant avec clinique et/ou hémogramme, mais la persistance d’une adénopathie sans cause infectieuse prouvée èbiopsie F oriente le Dg : pus (+ bactério), métastase, lymphome à confirmer par une biopsie

Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire Quand? devant une ou plusieurs adénopathies isolées non inflammatoires, non rapidement régressives, en l’absence de contexte infectieux patent (angine, etc…) vérifier l’absence de syndrome mononucléosique si possible après ponction permettant une orientation Comment? - Geste chirurgical sous AL ou AG, ou radiologique (micro-biopsies dirigées) - Si possible ne pas faire biopser en siège inguinal - Demander à biopsier l’adénopathie la plus volumineuse, si possible entière et la faire envoyer à l’état frais non fixé dans un délai de 2 H maximum - prévenir le laboratoire, lui adresser des informations cliniques

Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire Techniques Au laboratoire d’hématologie empreintes pour analyse cytologique d’orientation immédiate immunophénotypage (CFM, immunocytochimie) cytogénétique / biologie moléculaire (clonalité, recherche de translocations) Au laboratoire d’anatomie pathologique coupes des blocs après inclusion en paraffine immunohistochimie (antigènes cellulaire, protéines anormales) recherche de virus ou de marqueurs géniques en hybridation in situ analyse de clonalité/recherche de translocations

Examens complémentaires en hématologie caryotype Quand? èaffirmer la clonalité d’une anomalie hématologique (mais la relation clonalité-malignité n’est pas absolue) èmettre en évidence des anomalies spécifiques d’une affection donnée, à visée diagnostique (LMC, certains types de lymhpomes malins), pronostique (ds leucémies aigües), ou suivi de maladie résiduelle Comment? Mise en évidence d’anomalies chromosomiques de nombre et/ou de structure (translocations, déltions, inversions…) par cytogénétique conventionnelle (dénombrement et classement des chromosomes après culture courte de 18 à 48 H, bloquée au stade, métaphasique, analyse de 20 mitoses minimum) et/ou cytogénétique moléculaire par hybridation in situ fluorescente (FISH) ou peinture chromosomique, sur noyaux en métaphase ou interphase, permettant de préciser une anomalie, ou de la révéler si non trouvée sur le caryotype.

Jean Pierre A…. – caryotype sang du 09. 04. 99 Clone 1: 47, XY, +3, del(7)(q 31 q 35)

Examens complémentaires en hématologie caryotype En pratique èenvoi de sang (3 tubes de 5 cc), moëlle osseuse (1 cc) sur tubes héparinés, AVANT Tt cortico- ou chimiothérapique nécessite 20 millions de cellules, délai de réponse minimum: 3 -4 jours du lundi au vendredi (avant 14 H), prévenir si arrivée tardive èfragment de biopsie ganglionnaire frais non fixé pour les lymphomes malins Indications toutes les hémopathies où la cytogénétique a un intérêt diagnostique ou pronostique pouvant influencer le Tt Limites cellules tumorales trop peu nombreuses (pousse des cellules normales), ou non en cycle anomalies minimes anomalies génomiques et non chromosomiques, à recher en biologie moléculaire

Examens complémentaires en hématologie Étude du réarrangement des gènes des immunoglobulines ou du récepteur T Le réarrangement des gènes des IG ou du TCR est spécifique de la cellule dans laquelle il se produit, donc de toute population tumorale (qui dérive par définition d’une seule cellule-mère) Extraction de l’ADN cellulaire, utilisation de sonde spécifique de JH pour les Ig, du segment J du TCR , par PCR le + souvent Indications Recherche d’une population monoclonale B ou T (pas d’approche de clonalité immunologique) - bilan initial - recherche de maladie résiduelle examen très spécialisé à discuter avec le biologiste Limites technique : absence de clone identifiable dans un lymphome malin Interprétation: Présence de clones contrôlés non malins chez sujets sains