Evaluatie van een genotypische test voor detectie van

Evaluatie van een genotypische test voor detectie van polymorfismen in het integrase gen van verschillende HIV-1 subtypes De Ruddere Annelies

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

1. Situatieschets en probleemstelling n Drugresistentie bij HIV n Drugs gericht op verschillende targets n Nieuwe drug: integrase remmer raltegravir (RAL) => resistentie onderzoek vereist

Targets in de replicatiecyclus

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

2. Resistentie onderzoek globaal Ontwikkelen protocol voor sequenering integrase gen voor verschillende HIV-1 subtypes n Sequenering vóór starten RAL therapie => polymorfismen n Sequenering na starten RAL therapie => ontstaan en evolueren van mutaties n Invloed van polymorfismen op ontstaan van resistentie gelinkte mutaties n

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

3. Concrete doelstellingen Protocol voor sequenering evalueren n Natuurlijke variabiliteit in het integrase gen onderzoeken n Opsporen van polymorfismen die in literatuur worden geassocieerd met integrase remmer resistentie n

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

4. Protocol sequenering integrase gen n Definitie van een goede integrasesequentie Invloed van aantal amplificatiereacties? n Invloed van subtype? n Invloed van virale lading? n

4. Protocol sequenering integrase gen + analyse

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

5. Natuurlijke variabiliteit n Sequenties aligneren in Bio. Edit en vergelijken met subtype B referentie HXB 2

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

6. Resistentie geassocieerde mutaties n Sommige mutaties in literatuur reeds geassocieerd met integrase remmer resistentie n Sleutelmutaties: Q 148 H/R/K, N 155 H (en Y 143 R)

6. Resistentie geassocieerde mutaties Van vele mutaties is de exacte invloed op resistentie nog niet gekend. Vetgedrukt: reeds beschreven in de literatuur als

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

7. Resultaten: protocol Invloed van aantal amplificatiereacties => altijd nested PCR uitvoeren

7. Resultaten: protocol Invloed van subtype Vooral problemen bij subtype C Opm. : Niet van elk subtype evenveel stalen onderzocht

7. Resultaten: protocol Invloed van virale lading: Amplificatie en sequentieanalyse mogelijk bij virale lading < 1000 viruskopijen per ml.

7. Resultaten: polymorfismen 33, 7 % (97/288) van de aminozuurposities is polymorf n Opm. : Consensus per subtype i. p. v. HXB 2? n

7. Resultaten: resistentie geassocieerde mutaties n Op 13 posities zijn polymorfismen aanwezig die geassocieerd zijn met resistentie. n Geen sleutelmutaties gedetecteerd (Q 148 H/R/K, N 155 H of Y 143 R) als natuurlijk polymorfisme

7. Resultaten: resistentie geassocieerde mutaties

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

8. Conclusie Protocol: - altijd standaard nested PCR - verder onderzoek voor subtype C - nog meer subtypes onderzoeken n Polymorfismen: misschien in de toekomst beter een consensus gebruiken per subtype als referentie n Resistentie geassocieerde mutaties: soms reeds aanwezig als polymorfisme, maar nog weinig gekend over de exacte invloed n

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

9. Blik op de toekomst Sequeneringsprotocol voor integrase gen verder op punt stellen n Patiënten vooraf screenen bij start therapie met RAL om polymorfismen vast te stellen n Patiënten opvolgen na start therapie om te kijken welke mutaties ontstaan en hoe ze evolueren n Link tussen polymorfismen en later ontstaan van mutaties => RAL therapie nuttig of niet n

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Situatieschets en probleemstelling Resistentie onderzoek globaal Concrete doelstellingen Protocol sequenering integrase gen Natuurlijke variabiliteit Resistentie geassocieerde mutaties Resultaten Conclusie Blik op de toekomst Voorbeeld van patiënt onder RALtherapie

10. Voorbeeld van patiënt onder RAL -therapie Drie stalen genomen n 21/02/08: start therapie; geen sleutelmutaties n 08/03/08: ontstaan van Q 148 R n 25/04/08: Q 148 R weer verdwenen, ontstaan van N 155 H en E 92 Q. Reden van switch? ?

10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie Invloed van polymorfismen V 72 I en V 201 I niet gekend

Dank u voor uw aandacht