Estudo do complemento Prof Doutor Jos Cabeda Tcnicas
Estudo do complemento Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
O sistema do complemento Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (I) n CH 50 u Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro u Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC u A reacção é parada com PBS frio u A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria u Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de água pura). u Actividade do complemento dada pela diluição necessária para obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH 50/m. L soro. u Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo u Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH 50 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (II) n AH 50 u Semelhante ao CH 50, por se basear na quantificação da lise de eritrócitos u Baseia-se no facto de a via alterna ser activada por e provocar a lise de eritrócitos de coelho u Activação da via clássica inibida por quelatação do Ca 2+ com EGTA u A maior parte das deficiências de C 3 por consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C 3 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (III) n Outros u ELISA t Detecção do componente terminal da cascata de activação clássica • C 5 b-6 -7 -8 -9 u Medida de lise de liposomas contendo enzimas t Utiliza processos automáticos de quimica clínica Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (IV) n Testes funcionais para componentes do complemento u Fazer CH 50 ou AH 50 com t Complementação por soros deficientes num componente t Complementação componentes puros Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Testes quantitativos do complemento n n Quantificação de proteínas do complemento u Identificação das deficiências Quantificação de produtos de hidrólise do complemento u Diferenciação entre deficiência e consumo t C 4 a/C 4 ou C 4 d/C 4=> via clássica t Bb => via alterna t C 3 a e C 5 a => via final (mas têm curtas semi -vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa) u Nefelometria Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Colheitas n n n n Má colheita => deficiência de complemento Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação Soro com crioglobulinas tem que ser testado de imediato Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a – 70ºC Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento) Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento in vitro provocando falsa deficiência Hemólise interfere na leitura Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Análise Genética do C 4 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
O Gene do C 4 localiza-se no MHC-III Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
O gene do C 4 n n Prof. Doutor José Cabeda dois genes: u C 4 A (ácido) u C 4 B (básico) 6 p 21. 3 41 exões intrão 9 tem 7 Kb u Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb u Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb. Técnicas de Imunologia
Os Módulos RCCX n n Módulo RCCX u RP 1 u C 4 u CYP 21 u Tenascin X Normalmente 2 módulos em tandem u RP 1 -C 4 A-CYP 21 A-TNXA --- RP 2 -C 4 B-CYP 21 B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Os alelos C 4 A e C 4 B u o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um intermediário acídico n C 4 A u a asparagina, não sendo nucleofílica não origina a formação do intermediário pelo que a reacção de ligação ás outras moléculas é mais lenta Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda n
Taq. I - RFLP (quantificação dos elementos RCCX) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Taq I e psh. A I RFLP Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Imunofixação de C 4 A e C 4 B Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Determinação de fenótipo C 4 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
PFGE para genotipagem C 4 n n n M S => 75 Kb; L => 85 Kb B LS => 105 Kb; LL => 115 Kb T u LSS => 135 Kb u LLS => 140 Kb u LLL => 150 Kb Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Número de módulos RCCX RP 1 -C 4 A-CYP 21 A-TNXA --- RP 2 -C 4 B-CYP 21 B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
- Slides: 21