Estudo de doenas Autoimunes Doenas Autoimunes endcrinas Prof

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes endócrinas Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Patologias autoimunes sistémicas e de órgão n n n LES Lúpus discóide Esclerodermia Citopenias autoimunes Síndrome de Goodpasture n n n Cirrose Biliar Primária Hepatite crónica activa Síndrome Guillain-Barré Uveite Fibrose Pulmonar Idiopát. n n n Artrite reumatóide juvenil Sindrome de Sjögren DMID (Diabetes ) Psoriase Doença de Graves Doença de Hashimoto Esclerose Múltipla Colite ulcerosa Doença de Chron Miastenia Gravis Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Doenças Autoimunes endócrinas Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) n Doença de Graves n Diabete Melitus dependente de Insulina n Doença da Addison n Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Auto-antigénios de Doenças Autoimunes endócrinas n n n Tiroidite crónica u Tiroglobulina u Peroxidase da Tiroide (TPO) Doença de Addison u Antigénios Adrenais u Ovario, Testiculos, Placenta (uso em investigação) Hipoparatiroidismo u Antigénios da paratiróide (Ag citoplasmáticos) Anemia Perniciosa u Células parietais gástricas (subunidades a e b da ATPase H/K) Doença de Graves u TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina ) t TSAb imita a acção da TSH t TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo) t Testar a presença com células RFTL-5 ou substituto Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Diabetes Mellitus Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T n Estudo da função celular T não é prática n Presença de Autoanticorpos é marcador da doença n u u u Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença Testados por Imuno. Fluorescência, RIA ou ELISA Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Auto-antigénios na IDDM n n n Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) u Existem em 70 -80% dos doentes diagnosticados de novo u Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) t Bandas de 64 Kd e 50 Kd u Insulinoma Antigen (40 e 37 Kd) t IA-2 b u GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA) u Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Auto-antigénios na IDDM Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso n Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por autoanticorpos n Miastenia Gravis u n Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) u Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

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Estudo de doenças Auto-imunes Anemia Hemolitica Autoimune Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Anemias Hemoliticas autoimunes Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Anemias Hemoliticas autoimunes: Técnicas diagnósticas laboratoriais n Direct Antiglobulin Test (DAT) u Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivo u Usado para investigar : t Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) t Hemólise induzida por drogas t Doença Hemolitica do recém-nascido t Reacção aloimune á transfusão u Em WAMA (worm) Ig. G liga RBC de modo estável u Em CAD (cold) Ig. M liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C 3), libertando-se a Ig. M quando a circulação atinge zonas mais quentes u Em PCM (semelhante ao CAD mas com Ig. G u sangue coag. Activ. complemento falsos positivos Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

DAT: procedimento 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. n Colher sangue em EDTA (previne activ. complemento) Preparar RBC (2 -4%) em PBS 1 gota RBC em 3 tubos (a. Ig. G, a. C 3 b/C 3 d, e albumina como controlo) Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400 rpm) Adicionar 2 gotas de a. Ig. G, a. C 3 b/C 3 d, e 6% albumina Misturar e spin o tubo com a. Ig. G 15’’-3400 rpm Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinação Incubar 5 min-RT os restantes tubos Repetir 6 e 7 para os restantes tubos Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativo Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10 Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva trata-se de Reacção transfusional tardia. Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Eluição de anticorpos de RBC n n n Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) Ressupender RBC em solução de glicina a baixo p. H (promove a dissociação dos anticorpos) Centrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos n n 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. n n n Cold reactive Ab reagem a 0 -4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC Colher e manter amostra a 37ºC Spin 3400 rpm-1 min Incubar 5’ a 37ºC 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC Agitar; incubar 1 hora a 37ºC Spin 15’’-3400 rpm e examinar macroscópicamente Repetir 5 e 6 a 30ºC Repetir 5 e 6 a 22ºC Pos a 30 e 22ºC Ig patológicas Pos só a 22ºC Cold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Indirect Antiglobulin Test (IAT): (Antibody screen for RBC-Ab) n n Routine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: u 37ºC com agente “enhancer”* u Após adição de a-Ig. G (reagente coombs) Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8 -10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivos devidos a alo-anticorpos WAIHA geralmente pan-RBC * BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo de Alergias Quantificação de alergénios Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo de Alergias Estudos in-vivo Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Quantificação de Alergénios Skin testing n Protein content n Quantificação de alergénios individuais (RIA, ELISA, etc) n Imunoelectroforese n PAGE n Imunobloting n Inhibition immunoassays n Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Skin testing n n Para controlar a possibilidade de choque séptico u Médico disponível em SOS u Garrote disponível em SOS u 1 mg epinefrina disponível em SOS Seringa hipodérmica com 100 m. L alergénio u Injecção de 20 -50 m. L, cerca de 3 mm diâmetro u Observação aos 15 min t Medir dois diâmetros e calcular média u Nova observação aos 30 min Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Skin testing Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo de Alergias Testes Laboratoriais Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Testes laboratoriais para estudo de alergias n n n Determinação de Ig. E total Determinação de Ig. E específica para um alergénio Screening multialergénico Imunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseiros Skin testing Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

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Determinação de Ig. E total Captura com a. Ig. E conjugada com suporte sólido n Lavar n Reagir com a. Ig. E marcada n Lavar n Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) n Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Determinação de Ig. E específica para um alergénio Alergénio ligado a matriz sólida n Adicionar soro doente n Incubar e lavar n Reagir com a. Ig. E marcada n Lavar n Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) n Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Multiple Alergen Screens n n Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex: u Mistura de árvores u Mistura de relvas u Mistura de sementes u Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites u Pelo de cão e gato u Etc. . . Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Specific Ig. E Inhibition immunoassays n n n n Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de Ig. E específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

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