Estrutura dos cidos Nuclicos Aspectos Moleculares Enfoques Conceituais

Estrutura dos Ácidos Nucléicos Aspectos Moleculares & Enfoques Conceituais

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1866: Gregor Mendel

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1869 → Johann Friedrich Miescher # Buscava determinar os componentes químicos do núcleo celular. # Usava os glóbulos brancos contidos no pus para suas pesquisas (células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma). # Descobriu a presença de um composto de natureza ácida desconhecido até o momento (rico em fósforo e em nitrogênio, desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina - enzima proteolítica)) → nucleína

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1880 → Albrecht Kossel # Demonstrou que a nucleína continha bases nitrogenadas em sua estrutura. 1889 → Richard Altmann # Obteve nucleína com alto grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e dando-lhe o nome de ácido nucléico.

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns Redescoberta de Mendel Leis da Hereditariedade Leis de Mendel

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1928: Frederick Griffith: Transformação

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1944: Avery, Mac. Leod e Mac. Carty: Princípio transformante

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1953: Alfred Hershey e Martha Chase DNA 32 P Proteína 35 S

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR § 1953: James Watson e Francis Crick Maurice Wilkins e Rosalind Franklin

DNA → INTRODUÇÃO • Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicação é fundamental. • Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas. • Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de DNA. • DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que controlam a expressão gênica ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA

DNA → INTRODUÇÃO

DNA → INTRODUÇÃO

GENOMA HUMANO Autossomos x Sexuais 99% 1%

GENOMA HUMANO Nucleotídeo DNA Genoma Cromossomo

DEFINIÇÃO DE GENE r. RNA Ribossomos t. RNA RNP sn. RNA AA m. RNA Proteína

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Pentose (Açúcar) R OH Ribose -D-Ribofuranose H 2’-Desoxirribose -D-2 -desoxirribofuranose

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos PURINAS Bicíclicas Purina Adenina Guanina PIRIMIDINAS Monocíclicas Pirimidina Citosina Adenina = Timina Uracil Timina Guanina Citosina

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas PIRIMIDINAS Uracil Timina 5 -Metiluracil

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Posições dos Átomos Grupamento Fosfato Bases Nitrogenadas Pentose

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Nucleotídeo (2’-) Desoxirribonucleotídeo Nucleosídeo Ribonucleotídeo Nucleosídeo

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato Monofosfato - 5’-Monofosfato de Adenosina - AMP 5’-Monofosfato de Desoxiadenosina - d. AMP Difosfato - 5’-Difosfato de Adenosina - ADP 5’-Difosfato de Desoxiadenosina - d. ADP Trifosfato - 5’-Trifosfato de Adenosina - ATP 5’-Trifosfato de Desoxiadenosina - d. ATP

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Bases Nitrogenadas

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Sentido da Fita de DNA Base 5’ 3’ 5’AACGTTGCTATCGT 3’

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Bases Nitrogenadas Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH 2) Relação Molar (1949) (A+G) = (T+C) Chargaff A = 1, 0 T C = 1, 0 G AT = CG (? )

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Ligações Importantes Ligações Fosfodiéster Ligação ( -) Glicosídica (Glicosílica)

DUPLA-HÉLICE DO DNA Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade Ligações Covalentes Forças de Van der Walls Interações Iônicas (Mg+2) Sítios Hidrofóbicos Sítios Hidrofílicos Pontes de Hidrogênio

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO • Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA duplahélice fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação. • DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA. • RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA. • Esses processos podem ser observados in vitro

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através dos seguintes mecanismos: → aumento de temperatura → titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis aromáticos) → agentes desnaturantes (formamida) # Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice (levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares).

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de absorbância de luz ultravioleta (UV). Efeito Hipercrômico

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases. Adenina = Timina Uracil Guanina Citosina Tm (o. C) = 69, 3 + 0, 41(GC%) • Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é muito estável. • Para que estes processos ocorram há a necessidade da participação de enzimas especializadas (DNA-helicases e SSBs)

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO Rompimento das Pontes de Hidrogênio Tm (o. C) = 69, 3 + 0, 41(GC%) T (anelamento) (o. C) = Tm – 25 o. C

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO • Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas, o processo pode ser revertido. • Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente resfriada, as fitas complementares reassociam-se. T (anelamento) (o. C) = Tm – 25 o. C • No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta. • Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação # Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua renaturação.

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO

DUPLA-HÉLICE DO DNA As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno: → cavidade maior → cavidade menor # Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente. # Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas) podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da dupla-hélice.

DUPLA-HÉLICE DO DNA Antiparalelas

DUPLA-HÉLICE DO DNA Cavidades Maior e Menor Cavidade Maior Volta 0. 34 nm

DUPLA-HÉLICE DO DNA Cavidades Maior e Menor

DUPLA-HÉLICE DO DNA Cavidades Maior e Menor

TIPOS DE DNA O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua composição de bases e do meio em que se encontra → DNA A → DNA B → DNA Z Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de dupla-hélice clássica) Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal no meio em que se encontra o Tipo A.

TIPOS DE DNA Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA Tipo B ou Tipo A. # Fatores que estabilizam sua formação: → metilação ou bromação de bases → estresse torcional → ligação de proteínas específicas ao DNA • Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do DNA com proteínas.

TIPOS DE DNA

TIPOS DE DNA B DNA A DNA Z

TIPOS DE DNA B DNA A DNA Z

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO Conformação anti e syn Umidade Relativa (92%) Dupla RNA DNA B Etanol 75% [Sal] C 2’-endo DNA A C 3’-endo Metilação ou Bromação DNA Z

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO Principais características dos DNAs A, B e Z CARACTERÍSTICAS FORMA A FORMA B FORMA Z Sentido helicoidal (Giro) Direita Esquerda Diâmetro (nm) ~2, 6 ~2, 0 ~1, 8 Pb por giro (n) 11 10 12 Espaço entre as bases (nm) 0, 26 0, 34 0, 37 Inclinação da base 20 o 6 o 7 o Sulco maior Estreito/Profundo Largo/Profundo Achatado Sulco menor Largo/Raso Estreito/Profundo Ligação glicosídica anti(pir) sin(pur)

RNA x DNA H H

RNA x DNA

RNA mensageiro (m. RNA) Sinal de ligação ao Ribossomo CAU AUG Códon de Iniciação (Start Códon) AGGAGGU Início da Transcrição AAAAA Hairpin Fim da mensagem

RNA transportador (t. RNA)

RNA ribossomal (r. RNA)

OUTROS RNAs hn. RNA sno. RNA

RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi) Premio Nobel de Medicina 2006 Andrew Fire e Craig Mello

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear). # Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente, formam-se as chamadas estruturas circulares.

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Linear x Circular Plamídeos e Vírus

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO • Além da estrutura secundária da duplahélice, o DNA assume uma conformação tridimensional supertorcida. # A dupla-hélice enrola-se sob si mesma (extremamente importante nos processos de replicação, transcrição, recombinação e expressão gênica).

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Supertorções

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Estrutura Supertorcida, Suprerenrolada ou Super-hélice B C Topoisômeros A Grau de superenrolamento crescente A: Relaxada B: Superenrolamentos parciais C: Totalmente Superenrolado

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Tipos de Superenrolamentos • Plectonêmico → DNA em solução. • Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os nucleossomos. # O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas criciformes, triplex ou DNA Tipo Z.

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Tipos de Superenrolamentos Plectonêmi co Solução Toroidal Histonas

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO

TOPOISOMERASES § Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que diferem apenas na sua topologia. § Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos. • A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras. • Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas.

TOPOISOMERASES § Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA § Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice Participam de importantes etapas nos processos de replicação, transcrição e recombinação # o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas de DNA pode ser medido de diferentes maneiras.

TOPOISOMERASES Topoisomerase do tipo I Relaxamento de Superenrolamento ATP Ligação Fosfotirosina Restauração do DNA Ligação e Desnaturação E. coli § Topo I: Monômero de 100 k. Da (+ e –) § Mutação no Gene top. A Inviável § Topo III: Monômero de 74 k. Da (+) § Mutação no Gene top. B Viável

TOPOISOMERASES Topoisomerase do tipo II E. coli § Topo II Tetrâmero 400 k. Da § DNA-Girase Sub A e B § Adiciona Supertorções – § Gene gyr. A e gene gyr. B § Topo IV Catenadas § Antibióticos e Antitumorais 105 a 140 pb 5’-Tyr(122)A Central: 20 pb (AT) Lateral: Rica em GC

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Métodos de aferição do grau de superenrolamento • Eletroforese em gel de agarose → separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação (funções diretas do superenrolamento) → o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu tamanho e forma) # Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou supertorcida.

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Métodos de aferição do grau de superenrolamento Velocidade de Sedimentação Gel Agarose Microscopia Eletrônica

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Tratamento com Topoisomerase 5 Min 30 Min

CONSIDERAÇÕES FINAIS § Ácidos Nucléicos maiores representantes do genótipo (DNA) § Proteínas maiores representantes do fenótipo § DNA Envolvido com todo metabolismo do organismo § Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas Informações § DNA Moléculas principais § RNA Moléculas intermediárias § Proteína Resultado final da informação