ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETANA ALDEHDO DESHIDROGENASA DE
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA DE ESPINACA González Segura, Lilian 1*, Díaz Sánchez, Ángel G. 1, Rudiño Piñera, Enrique 2, Mújica Jiménez, Carlos 1 , Montiel, Carmina 1 y Muñoz Clares, Rosario A. 1 1 Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F. , 04510, México. y 2 Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, Mor, 62210, México. Correo electrónico: lilgonzalezseg@gmail. com Sitio activo Introducción El paso final en la biosíntesis del osmoprotector glicina betaína en plantas superiores que se lleva a cabo en los cloroplastos es la oxidación irreversible de betaína aldehído a glicina betaína en la reacción catalizada por la betaína aldehído deshidrogenasa (BADH). NAD+ La posición del agua 2 (Wat 2) es la que más se acerca a la trayectoria de Bürgi-Dunitz, que es la ideal para que un nucléofilo realice el ataque nucleofílico sobre el carbono de un carbonilo. Pero esta agua sólo puede estar presente cuando existe una Val en la posición equivalente a Trp 456, como en la Pa. BADH. Si el residuo en esta posición es Phe, Trp o His la molécula de agua no puede colocarse en la posición de Wat 2. Lys 168 NADH Glu 467 NAD+ H 2 O El análisis de la estructura de la Sp. BADH nos llevó a proponer a Wat 1 como un buen candidato para ser el agua hidrolítica, debido al gran volumen del Trp 456 que es incompatible con Wat 2. Glu 257 H+ Glicina betaína Betaína aldehído En plantas como espinaca que acumulan glicina betaína en respuesta al estrés osmótico producido por sequía, suelos salinos o bajas temperaturas, los niveles de RNAm, de proteína y de actividad de BADH se incrementan bajo este tipo de estrés (1). La BADH de espinaca (Sp. BADH) es un dímero con 497 residuos por subunidad. La Sp. BADH utiliza como coenzima al NAD+. El mecanismo químico de la reacción catalizada por las ALDHS involucra 3 pasos principalmente: 1) el ataque nucleofílico del tiol de la cisteína catalítica sobre el carbono del aldehído (acilación), el cual produce un intermediario tiohemiacetal; 2) la transferencia del hidruro del intermediario tiohemiacetal al anillo de piridina del NAD(P)+ que produce un intermediario tioéster y 3) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el tioéster (desacilación). El objetivo principal de este trabajo fue obtener la estructura tridimensional de la Sp. BADH con el fin de caracterizar estructuralmente a esta enzima y conocer más a fondo su mecanismo de reacción y regulación. Trp 456 Transferencia del hidruro Parámetros cinéticos y de unión al equilibrio del NAD(H) de la enzima silvestre y Trp 456 Val Cys 291 Entrada del aldehído Cys 450 Figura 3. Acercamiento del sitio activo de la Sp. BADH mostrando los residuos catalíticos. La cisteína catalítica, Cys 291, está en la conformación de ataque, que es la posición adecuada para realizar el ataque nucleofílico sobre el aldehído. El anillo de nicotinamida del NAD+ se observó dentro del sitio activo en la posición de “transferencia del hidruro”. El glutámico catalítico, Glu 257 que participa como una base general en la activación de una molécula de agua hidrolítica, se encontró en una conformación no observada en ningún otro cristal de una ALDH, interaccionando con el carbonilo del Trp 456. Otro hallazgo novedoso en esta estructura es el puente de hidrógeno entre el oxígeno de la carboxiamida y el NE 1 del Trp 456. Resultados y discusión Grupo espacial Dimensiones de la celda a, b, c (Å) , β, (grados) Unidad asimétrica Intervalo de resolución (Å) Reflexiones únicas Integridad (%) I/ (I) Rmerge (%) Rwork (%) Rfree (%) 69. 63 81. 30 85. 70 78. 9, 84. 8, 77. 9 dos dímeros 47. 29 -2. 25 80071 99. 9 (94. 58) 6. 9 (1. 9) 7. 4 (38. 5) 21. 74 25. 22 A Arg 40 KA es la Km aparente para el NAD+, KB es la Km aparente para la betaína aldehído. La mutación Trp 456 Val produjo una enzima que tiene una afinidad menor por NAD(H), medida ésta tanto por estudios de velocidad inicial como por unión al equilibrio, y por el aldehído, medida por la Km. Unión al equilibrio del nucleótido en la Sp. BADH silvestre B Ala 41 Figura 4. Sitio de unión del NAD(P)+. A. Pa. BADH. B. Sp. BADH. Unión al equilibrio del nucleótido en la Sp. BADH Trp 456 Val En el pánel A se muestra el puente salino del Glu 179 con la Arg 40 en la Pa. BADH, lo cual aleja al carboxilato del 2’ fosfato del NADP+ evitando la repulsión electrostática entre estos dos grupos (3). Mientras que en la Sp. BADH (pánel B) en la posición de la Arg 40 se encuentra una Ala, lo cual no atrae ni estabiliza al Glu 185 hacia la conformación observada en la Pa. BADH. dominio catalítico Trp 161 Val 453 Trp 456 Cys 286 Cys 291 Ser 447 Betaína aldehído dominio de oligomerización Trp 167 Efecto isotópico del D 2 O sobre la kcat de las enzimas silvestre y Trp 456 Val Cys 450 Betaína aldehído Tyr 154 Val 285 A Ile 290 Tyr 160 B B A Figura 5. Sitio de unión de betaína aldehído modelado por docking rígido. A. Pa. BADH. B. Sp. BADH. Figura 1. Estructura tridimensional de la Sp. BADH. A) Monómero. La cisteína catalítica (Cys 291) se encuentra representada en esferas amarillas. B) Dímero. La topología de la Sp. BADH es muy similar a la que se ha descrito para las ALDHS, sólo difiere en el dominio de oligomerización que tiene dos hebras, en lugar de tres que tienen las enzimas tetrámericas. El Trp 456 en la Sp. BADH estabiliza la conformación del Trp 167, permitiendo que éste interaccione con el aldehído, a diferencia de la Val 453 de la Pa. BADH que no fija al Trp 161, por lo que éste no interacciona con el aldehído. Leu 258 A Glu 257 Entrada del aldehído Wat 1 Vistas laterales 3. 1 3. 5 2. 9 Wat 2 Trp 456 Sp. BADH ALDH 2 (1 O 01) Pa. BADH (2 WME) ALDH 3 (1 AD 3) BADH de bacalao (1 A 4 S) Sm. GAPN (1 EUH) Bh. ALDH (3 I 44) Tt. GAPN (1 UXU) Entrada del aldehído Cys 291 Figura 2. Representación del dímero en superficie mostrando el potencial electrostático. En rojo se observan las cargas negativas, en azul las cargas positivas y en blanco las neutras. Figura 2 A. Dímero con la misma orientación que en la Fig. 1 B. La cavidad central de la intercara entre los monómeros y los dominios de oligomerización presentan un gran número de cargas positivas, mientras que la región de entrada del aldehído está rodeada de cargas negativas. silvestre mutante H 2 O kcat (s-1) 3. 78 14. 33 D 2 O kcat (s-1) 2. 47 7. 44 H 2 O kcat (s-1) / D 2 O kcat (s-1) 1. 53 1. 92 La mutante Trp 456 Val mostró un efecto isotópico del solvente sobre la kcat mayor que el de la enzima silvestre, indicando que el paso de hidrólisis del intermediario tioéster de la reacción es más limitante de la velocidad en la enzima mutante que en la silvestre. B 180 Entrada del nucleótido 13. 1 ± 1. 0 27. 8 ± 2. 0 132. 1 ± 22. 0 5. 24 x 105 3. 96 x 109 8. 0 ± 0. 5 0. 930 ± 0. 05 Cinética de saturación de la Sp. BADH silvestre y Trp 456 Val Glu 185 Glu 179 Estructura tridimensional Entrada del nucleótido 3. 2 ± 0. 2 11 ± 2. 0 54 ± 3. 0 3. 25 x 105 6. 01 x 109 5. 7 ± 0. 32 ± 0. 03 P 1 Los datos entre paréntesis corresponden a la faja de alta resolución. La estructura presentada está en proceso de refinamiento. dominio de unión a la coenzima NAD+ NADP+ mutante Ambos resultados son consecuencia de la pérdida de las interacciones que hace el Trp 456. La mutante posee una kcat cuatro veces mayor que la enzima silvestre, lo que indica que el paso limitante de la reacción ha cambiado. Datos cristalográficos de la Sp. BADH con NAD+ Estadística de la colecta de datos y refinamiento Vmax (U/mg P) KA (μM) KB (μM) kcat/KA (s-1 M-1) kcat/KAKB (s-1 M-2) Kd. NADH (μM) Kd. NAD+ (μM) silvestre Figura 6. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHS. Se han propuesto varias moléculas de agua ordenadas en el sitio activo de las ALDHS que pueden llevar a cabo la hidrólisis del intermediario tioéster. En la Fig. 6 se presentan dos de estas moléculas de agua. Sin embargo, en la Sp. BADH no se observa ninguna de estas dos moléculas de agua, ya que éstas son estéricamente incompatibles con el NAD+. Los resultados anteriores sugieren que el Trp 456 podría estar participando en la colocación de Wat 1 y del nucleótido. Referencias 1. Weretilnyk, E. A. y Hanson, A. D. (1989) Arch Biochem Biophys, 271, 5663. 2. Valenzuela-Soto, E. M. y Muñoz-Clares, R. A. (1993) J Biol Chem, 268, 23818 -23823, and Additions and Corrections, J. Biol. Chem. 269, 4692. 3. González-Segura, L. , Rudiño-Pinera, E. , Muñoz-Clares, R. A. and Horjales, E. 2008. (2009) J. Mol. Biol. 385, 542 -557. Agradecimientos Trabajo financiado por DGAPA (IN 204708) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (101986).
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