ESTRUCTURA PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS Transferencia

ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Transferencia de material genético II: Transformación Pérez Reséndiz Enrique Leonardo

Ingeniería genética � Es una herramienta que permite la manipulación del material genético in vitro. � Se sustenta en técnicas que permiten aislar, caracterizar y manipular DNA. � Para la generación de un organismo genéticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones.

Ingeniería genética � Enzimas fundamentales: �Endonucleasas de restricción �Ligasas �Fosfatasas �Cinasas �Polimerasas �Transcriptasa reversa �Helicasas

Vectores de clonación � Es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar. � Los vectores permiten obtener múltiples copias de un trozo de DNA.

Vectores de clonación 1. 2. 3. 4. 5. Replicación independiente (ori*): Sirve para la replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero. Sitios de corte únicos: Permite la apertura del DNA (enzimas de restricción), denominado sitio múltiple de clonación Marcador de selección: Permiten aislar a las células hospederas con el vector (genes de resistencia a antibióticos). *Recuperación sencilla. *Promotores fuertes.

Vector recombinante � Molécula del DNA del vector con DNA de interés. � Para la unión del DNA de interés se utilizan ligasas.

Transformación

Transformación � Para la introducción del DNA existen diferentes técnicas: �Choque térmico. �Microelectroporación.

Choque térmico � Las bacterias hospederas son pretratadas con agentes que aumentan su permeabilidad membranal, como la temperatura y los iones. � Los iones como el Ca 2+, disminuyen la repulsión de cargas eléctricas entre los nucleótidos y la membrana, facilitando la entrada del plásmido al interior de la célula.

Células competentes o células transformantes � Las células que recibieron un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción del material genético se les denomina células competentes. � Las células transformantes son las células competentes que se les introdujo el material genético, a las cuales se les restauro su permeabilidad de la membrana y se encuentran en condiciones óptimas de crecimiento.

Objetivos Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. � Realizar la técnica de transformación bacteriana. � Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. � Conocer la definición de organismo transgénico. � Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos. �

Material � Células competentes de E. coli. � Plásmido PET-TEM-1: �Vector recombinante p. ET-TEM-1 -omp. Aβ- lactamasa. � Cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/m. L). � Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 m. M Glucosa.

Desarrollo experimental � Transformación 1. 2. 3. 4. de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico. Añadir 1 a 5 µL del plásmido en el tubo de las células de E. coli competentes. Mezclar. Dejar en hielo por 30 minutos. Dar choque térmico a 42ºC durante 45 segundos (NO AGITAR).

Desarrollo experimental Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37ºC con agitación 225 a 250 rpm. 6. Concentrar las células por centrifugación. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC. 7. Esparcir los 100 µL de bacterias transformadas, en las cajas con medio de selección (Agar -LB-Kanamicina). 5.

Desarrollo experimental Incubar a 37ºC por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4ºC. 9. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en medio de selección a 37ºC por 24 h. 10. Calcular la eficiencia de la transformación. 8.

Resultados � Se utilizara como indicador la resistencia a Kanamicina. � Las células que crecen en el medio Agar -LB-Kanamicina, son las células transformantes.

Resumen

Examen Qué es un vector de clonación y da las tres características? 2. Da el nombre del método que se usará para la transformación 3. Y explica en que consiste 4. Que diferencia hay entre conjugación y transformación 1.

Gracias por su atención FIN