ESTRAZIONE LA PROCEDURA ADOTTATA DIPENDE Dalla fonte Origine

ESTRAZIONE LA PROCEDURA ADOTTATA DIPENDE: Dalla fonte: Origine cellule animali Esempi di metodologie -shock osmotico o lisi osmotica -cicli di congelamento e scongelamento -digestione enzimatica -solventi organici ** rottura meccanica con agenti abrasivi, frullatori, omogeneizzatori, estrusione ad alta pressione, ultrasuoni. cellule vegetali microrganismi -metodi meccanici** -lisozima

Dalla localizzazione cellulare: proteine extracellulari proteine intracellulari e presenti negli organelli cellulari proteine di membrana

CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE (o esclusione molecolare) Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare • FASE MOBILE: solvente • FASE STAZIONARIA: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte) P=rgh Livello minimo di sicurezza dell’eluente

CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE (esclusione molecolare) Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare

Fase stazionaria: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte) Fase mobile: solvente I soluti di dimensioni minori possono penetrare nei pori, e migrano più lentamente I soluti le cui dimensioni superino il diametro dei pori (limite di esclusione), ne rimangono esclusi, e passano più velocemente attraverso gli spazi interstiziali dei granuli

Un singolo granulo di gel (in giallo) è qui schematicamente rappresentato come una struttura sferica contenente dei pori: - le particelle grandi (in rosso) non riescono a penetrare nei pori e passano più rapidamente attraverso la fase stazionaria, eluendo per prime dalla colonna; - le particelle più piccole (in blu), penetrando nei pori dei granuli di gel, ne vengono “intrappolate” cosicché la loro corsa lungo la colonna è rallentata, in proporzione alle dimensioni.

VO = Volume vuoto o interstiziale VX = Volume dei granuli di gel VT VX V 0 VT = Volume totale VT = V O + V X VEi = Volume di Eluizione Per ogni soluto i, si definiscono KDi e VEi : VEi = VO + KDi VX (V di solvente necessario ad eluire il soluto i ) KDi = Coefficiente di distribuzione (frazione di ripartizione di i tra VX e VT ) 0 < KD i < 1 VEi / VO è il volume di eluizione relativo (indipendente dalla colonna e dal gel)

Sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, a seconda del LIMITE DI ESCLUSIONE e dell’ INTERVALLO o CAMPO DI FRAZIONAMENTO Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (k. D) Sephadex G-10 Destrano 0. 05 - 0. 7 Sephadex G-25 Destrano 1 -5 Sephadex G-50 Destrano 1 - 30 Sephadex G-100 Destrano 4 - 150 Sephadex G-200 Destrano 5 - 600 Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 0. 1 - 1. 8 Bio-Gel P-6 Poliacrilammide 1 -6 Bio-Gel P-10 Poliacrilammide 1. 5 - 20 Bio-Gel P-30 Poliacrilammide 2. 4 - 40 Bio-Gel P-100 Poliacrilammide 5 - 100 Bio-Gel P-300 Poliacrilammide 60 - 400 Sepharose 6 B Agarosio 10 - 4000 Sepharose 4 B Agarosio 60 - 20000 Sepharose 2 B Agarosio 70 - 40000

Struttura del destrano, una resina polimerica in commercio con il nome di Sephadex

STADI DEL PROCESSO • Scelta del gel. La resina è venduta in forma DISIDRATATA. È necessario perciò idratare la resina (RIGONFIAMENTO) con acqua o con il solvente della miscela proteica. • È opportuno DISAERARE il gel con una beuta da vuoto prima del caricamento. • Il caricamento della colonna va effettuato lentamente, onde evitare la formazione di bolle d’aria. • Si sovrappone alla fase stazionaria la soluzione della miscela proteica da separare • Si fa fluire la fase mobile (soluzione tampone) generalmente mediante una pompa peristaltica • Si raccoglie l’eluito in provette con un collettore, e lo si analizza attraverso un rivelatore, in genere uno spettrofotometro

Cromatogramma o grafico di eluizione che mostra la separazione completa dei componenti il campione da analizzare A 280 nm Veluizione o numero della provetta La cromatografia ad esclusione viene utilizzata non solo per la separazione di composti biologici, ma anche per la determinazione del peso molecolare

Costruzione CURVA DI TARATURA Il Veluizione relativo (VEi / VO) varia linearmente con il logaritmo del peso molecolare

Cromatografia a scambio ionico

Cromatografia per affinità

Cromatografia per affinità