Espectroscopia RMN 2 D Hasta ahora hemos visto

Espectroscopia RMN 2 D • Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola dimension (osea, espectros 1 D), pero vimos como una secuencia de pulsos multiple nos da distintos espectros en funcion de los periodos t. D que usemos entre pulsos. • Un experimento 2 D basico seria repetir una secuencia de pulsos 1 D con una vriacion sistematica del periodo de tiempo variable t. D, y luego graficar todo encimado (stacked plot). Un ejemplo seria variar el tiempo antes de tomar la FID (DE): t. D 1 t. D 2 … t. D 3 … t. Dn • Ahora tenemos dominios de tiempo, uno que aparece durante la adquisicion como siempre, y otro que se origina a causa del periodo variable.

Las basicas de la RMN 2 D • Tenemos que renombrar algunos de los parametros para estar a tono con la literatura: • A la primera perturbacion del sistema (pulso) se le llama la preparacion del sistema de espines. • Al tiempo variable t. D lo renombramos tiempo de evolucion, t 1. • Tenemos un evento de mezclado, en el cual informacion de parte del sistema de espines pasa a otras partes. • Finalmente, vamos a tener un periodo de adquisicion (t 2) como en todos los experimentos 1 D (la FID). • Esquematicamente, lo podemos dibujar asi: Preparacion Evolucion t 1 Mezclado Adquisicion t 2 • t 1 es el periodo variable, y t 2 es el periodo de adquisicion normal. Vemos que vamos a tener frecuencias f 1 y f 2… • Este formato es basicamente el mismo para todas las secuencias de pulsos 2 D (y en realidad n. D). . .

Un experimento 2 D rudimentario • Vamos a ver como esto con el esqueleto de lo que va a ser la secuencia de pulsos COSY. Imaginense estos pulsos, donde t 1 es el tiempo de preparacion: 90 y 90 x t 2 t 1 • Lo analizamos para una singulete fuera de resonancia (wo), y para un monton de t 1’s diferentes. Empezando luego del primer pulso p / 2: z y 90 x x x wo y

El 2 D rudimentario (continuado) z y 90 x x x wo y z y 90 x x wo x y • El segundo pulso p / 2 actua solo sobre la componente de la magnetizacion que este en el eje y del plano <xy>. • La componente en el eje x no es afectada, pero su amplitud va a depender de la frecuancia del pico. A(t 1) = Ao * cos(wo * t 1 )

El 2 D rudimentario (mas…) • Si hacemos un stacked plot, nos da: A(t 1) t 1 wo f 2 (t 2) • Ahora tenemos datos en frecuencia en un eje (f 2, que viene del tiempo t 2), y datos en funcion del tiempo en el otro (t 1). • Como la variacion de intensidad en t 1 es tambien periodica, podemos hacer una seudo-FID mirando a los puntos para cada frequencia de los picos en f 2. • Una cosa que no estamos considerando durante todos estos pulsos, esperas, puslos, etc. , es que la señal tambien va a estar afectada por relajacion T 1 y T 2.

El 2 D rudimentario (y mas…) • Ahora tenemos FIDs en t 1, y podemos hacer una segunda transformada de Fourier en el dominio de t 1 (la primera fue el dominio de t 2), y obtenemos un espectro bi-dimensional: wo • Tenemos ‘cross-peaks’ donde las dos lineas se wo interceptan en el mapa 2 D, en este caso en la diagonal. f 1 f 2 • En un espectro real con un monton de señales mirar esto es imposible. Lo miramos desde arriba, y tenemos un espectro de contornos. Rebanamos los picos distintas alturas. wo wo f 1 f 2 • Cada rodaja tiene un codigo de color que depende de la altura del pico.

Lo mismo con datos reales • Esto es del COSY de la pulegona. . . tiempo-tiempo t 1 t 2 tiempo - frecuencia t 1 f 2 frecuencia - frecuencia f 1 f 2

Lo mismo con datos reales (continuado) • El espectro de contornos con todos los cross-peaks: f 1 f 2 • ¿De donde salieron todos los picos fuera de la diagonal (off-diagonal), y que quieren decir? • Voy a tratar de explicarlo, pero esto es algo para lo cual necesitariamos de un tratamiento matematico riguroso para entenderlo bien.

Correlacion homonuclear - COSY • COSY significa COrrelation Spectroscop. Y, y en este caso en particular en que lidiamos con acoples homonucleares, espectroscopia de correlacion homonuclear. • Cuando desarrollamos la idea del espectro 2 D consideramos un espin aislado sin acoples a nada mas. Obviamente, esto no es muy util. • El COSY es util para averiguar que espin esta acoplado con otros espines. Los picos fuera de la diagonal indican esto, osea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados. • Con esta idea basica vamos a tratar de ver el efecto de la secuencia de pulsos COSY 90 y - t 1 - 90 y - t 2 en un par de espines acoplados. Si recordamos el diagrma de energia de este sistema: J (Hz) a. Ib. S • • b. Ib. S I S • • S I • • a. Ia. S b. Ia. S I S • Si miramos al nucleo I y aplicamos los dos pulsos p / 2 (un seudo-pulso p), invertimos parte de la poblacion del espin S, y esto tiene un efecto en I (transferencia de polarizacion ).

Correlacion homonuclear (continuado) • Como la tranferencia de polarizacion de I a S o de S a I es lo mismo, lo explicamos de I a S y asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S. • Despues del primer p / 2, tenemos dos vectores de I en el eje x, uno moviendose a w. I + J / 2 y el otro a w. I - J / 2. El del segundo pulso va a poner componentes de la magnetizacion alineada con +y en el eje -z, lo que quiere decir que tenemos una inversion parcial de las poblaciones de I. • Para t 1 = 0, tenemos inversion completa de los espines I (es un pulso p) y la intensidad de la señal de S no cambia. Para todos los otros tiempos va a haber un cambio en la inensidad de S que depende periodicamente de la frecuencia de resonancia de I. • La variacion en la inversion de poblacion de I depende del coseno (o el seno) de su frecuencia de resonancia. Considerando que estamos en resonancia con una de las lineas y que t 1 = 1 / 4 J: z y 90 y x x J/2 y

Correlacion homonuclear (mas…) • Para el caso general (nada en resonancia), llegariamos a esta relacion para el cambio de la intensidad de la señal de S (depues del pulso p / 2) en funcion de la frecuencia del espin I y el acople JIS: AS(t 1, t 2) = Ao * sin( w. I * t 1 ) * sin (JIS * t 1 ) * sin( w. S * t 2 ) * sin (JIS * t 2 ) • Despues de la transformada de Fourier en t 1 y t 2, y teniendo en cuenta tambien al espin I, nos da: w. S w. I w. S f 1 f 2 • Esta es la ‘huella’ tipica de un doblete en un COSY con fase sensitiva (phase-sensitive COSY). Los senos hacen que las señales sean dispersivas en f 1 y f 2.

Correlacion heteronuclear - HETCOR • El COSY (o experimento de Jenner) fue uno de los primeros 2 D (1971), y es una de las secuencias de pulso 2 D mas utiles para elucidacion estructural. Tiene miles de variaciones y mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc. ). • De manera similar podemos hacer un experimento 2 D para determinar conectividad heteronuclear, osea, que 1 H esta conectado a que 13 C. Se le llama espectroscopia de correlacion heteronuclear (HETeronuclear CORrelation spectroscopy, o HETCOR). • En este caso, la secuencia involucra tanto 13 C como 1 H, ya que de alguna manera tenemos que marcar las intensidades de los 13 C con lo que le hacemos a las poblaciones de 1 H. La secuencia basica es: 90 13 C: 90 1 H: 90 t 1 {1 H}

HETCOR (continuado) • Analizamos primero lo que le pasa a los 1 H’s en un CH (osea, vamos a ver como afectamos a las poblaciones de 1 H), y despues vemos como afectamos a la señal de 13 C. Para diferentes valores de t 1 tenemos: z y 90, t 1 = 0 90 x x y z y 90, t 1 = J / 4 90 x x y z y 90, t 1 = 3 J / 4 90 x x y

HETCOR (mas…) • Como en el COSY, vemos que dependiendo del tiempo t 1 que usemos, tenemos una variacion periodica en la inversion de poblacion de los 1 H. Podemos ver claramente que la inversion depende del acople JCH. • A pesar de que lo hicimos en resonancia para simplificar, podemos ver que esta variacion tambien va a depender de la frecuencia de los 1 H (d). • De lo que sabemos de IPS e INEPT, podemos predecir que la variacion en las poblaciones de 1 H va a tener el mismo efecto periodico en la transferencia de polarizacion a 13 C. En este caso, el diagrama de energia para dos espines (1 H y 13 C) seria: a. Cb. H • • 13 C 4 2 1, 2 b. Cb. H 3, 4 1 H 1 H a. Ca. H • • • • • 1 • • • • b a 1, 3 2, 4 C H 13 C 3 I S • Ahora, como la intesidad de la señal de 13 C que detectamos en t 2 esta modulada por la frecuencia del 1 H acoplado, la FID de 13 C tiene informacion sobre las frecuencias de 13 C y de 1 H.

HETCOR (y mas…) • De nuevo, la intensidad de las lineas de 13 C’s va a depender de la inversion de poblacion de 1 H’s, osea, de w 1 H. Si graficamos a distintos t 1’s, nos da: • La intensidad de las dos lineas de 13 C va a variar con w 1 H y JCH entre +5 y -3 como en el caso de la secuencia INEPT. t 1 (w 1 H) w 13 C f 2 (t 2) • Matematicamente, la intensidad de una de las lineas de 13 C del multiplete va a ser una ecuacion que depende de w 13 C en t 2, de w 1 H en t 1, y de JCH en las dos dimensiones: A 13 C(t 1, t 2) trig(w 1 Ht 1) * trig(w 13 Ct 2 ) * trig(JCHt 1) * trig(JCHt 2)

HETCOR (y mas…) • Una transformada de Fourier en las dos dimensiones nos da es espectro de correlacion 2 D (como contornos): w 13 C JCH w 1 H f 1 f 2 • La diferencia principal con el COSY es que el espectro 2 D no es simetrico, porque un eje tiene frecuencias de 13 C y el otro de 1 H. • Barbaro, pero todavia tenemos acople JCH en todas las señales del espectro 2 D que aparecen como cuadrados. El rango de JCH es 50 - 250 Hz, y por lo tanto vamos a tener un monton de superposicion de cross-peaks de distintos sistemas de espines CH. • Vamos a ver como eliminamos esto sin desacoplar (si desacoplamos todo el tiempo eliminamos la transferencia de polarizacion de 1 H a 13 C. . . ).

HETCOR sin acople JCH • La idea es basicamente hacer lo mismo que hicimos en el experimento INEPT reenfocado. 180 t 1 / 2 90 t 1 / 2 13 C: 90 1 H: 90 t 1 D 2 {1 H} • El pulso de p en 13 C es para reenfocar la magnetizacion de 1 H, y los dos periodos variables estan para maximizar la transferencia de polarizacion de 1 H a 13 C y para tener reenfoque de los vectores de 13 C antes de desacoplar. • Como en el INEPT, la efectividad de la transferencia va a depender del periodo D y del tipo de carbono. Usamos un valor promedio. • Analizamos el caso de un carbono CH. . .

HETCOR sin acople JCH (continuado) • Para cierto valor de t 1, el comportamiento de la magnetizacion de 1 H es: z y a (w 1 H - J / 2) 90 t 1 / 2 x b (w 1 H + J / 2) y b y a y 18013 C t 1 / 2 a b x x b a • Si hacemos que D 1 sea 1 / 2 J, los dos vectores de 1 H van a desfasarse exactamente 180 grados. Aca es que tenemos la mayor inversion de poblacion para este t 1 en particular, y ningun efecto JCH: z y b 90 D 1 b a x x y a x

HETCOR sin acople JCH (mas…) • ¿Que pasa con la magnetizacion de 13 C? Despues del p / 2 en 1 H vamos a tener dos vectores de 13 C separados en un radio 5 / 3 en el eje z. Despues del segundo periodo D 2 (que lo hacemos 1 / 2 J) se van a reenfocar: z y y 5 90 D 2 x y 5 3 x 5 x 3 3 • Ahora podemos desacoplar 1 H porque la magnetizacion de 13 C esta reenfocada. El espectro 2 D no tiene acoples J CH (pero aun tiene informacion de corrimientos quimicos), y lo vemos como un solo cross-peak centrado en los corrimientos quimicos de 1 H y 13 C: w 1 H f 1 f 2 w 13 C

HETCOR de larga distancia • Los periodos D 1 y D 2 estan seleccionados de forma de maximizar la magnetizacion en antifase de 13 C para acoples 1 J. Osea, D y D estan en el rango de 2 a 5 ms (el 1 J CH 1 2 CH promedio es ~ 150 Hz, y los periodos D 1 y D 2 eran 1 / 2 J). • Esto funciona para protones y carbonos directamente enlazados (1 JCH). Si tomamos como ejemplo parte de lo que seria el HETCOR del alcanfor: b a • Una expansion del espectro para los carbonos a y b seria mas o menos asi : f 2 (13 C) Hb f 1 (1 H) Ha Hc Ca Cb

HETCOR de larga distancia (continuado) • El problema es que los carbonos a y b son muy parecidos quimica y magneticamente: Solo con esta informacion no podemos determinar cual es cual. • Seria bueno poder determinar cual de los dos carbonos esta mas cerca al proton en Cc, ya que de esa forma podriamos asignar inequivocamente los dos carbonos en el alcanfor: Hb b Ha c a Hc Ca Cb • ¿Como podemos hacer esto? Hay, en principio, una experimento muy simple que se basa en acoples C-H de larga distancia. • Aparte de los acoples 1 JCH, los carbonos y protones van a and tener acoples de larga distancia, que van a ser de dos o tres enlaces (2 JCH o 3 JCH). Las magnitudes son mucho mas chicas que las de los acoples directos, pero igual son considerables, entre 5 y 20 Hz. • ¿Podemos modificar el HETCOR para que nos muestre nucleos correlacionados por acoples de larga distancia?

HETCOR de larga distancia (mas…) • La clave esta en entender lo que hacen los periodos variables en la secuencia, en particular D 1 y D 2. Estos se usaban para reenfocar magnetizacion de 13 C en antifase. Para la parte de la secuencia en 1 H: z y b 90 D 1 b a x x y a • Para la parte en 13 C: z y y 5 90 x y 3 D 2 3 5 x 3 • Para reenfocar, osea, para obtener los vectores ‘-3’ y ‘+5’ alineados, y en el caso de un CH, los periodos D 1 y D 2 tienen que ser 1 / 2 * 1 JCH. ¿Que pasaria si cambiamos los periodos D 1 y D 2 a 1 / 2 * 2 JCH?

HETCOR de larga distancia (y mas…) • Para empezar, D 1 y D 2 van a ser ~50 ms, mucho mas largos que antes (~5 ms). Lo que va a pasar ahora es que la magnetizacion de 13 C que este en antifase debido a acoples 1 J CH no se va a reenfocar, y va a tender a cancelarse. Para la parte del reenfoque de 1 H: z y b a D 1 90 x x b y a • Los periodos variables no tienen nada que ver con 1 JCH, y no tenemos inversion completa de las poblaciones de 1 H. Ahora, para la parte de 13 C: z y <5 <5 90 <3 x y <3 D 2 x y • Cuando desacoplemos 1 H, vamos a eliminar casi toda la señal de 13 C que evoluciono bajo efectos de 1 JCH… x

HETCOR de larga distancia (y mas…) • Al final, vemos que la mayor parte de la magnetizacion que eveoluciono bajo efectos de 1 JCH’s (tanto 1 H o 13 C) va a desaparecer. En cambio, la magentizacion de 13 C en antifase que se origino debido a 2 JCH’s a tener los D 1 and D 2 correctos, y se va a comportar como vimos antes. Para 1 H: z y b 90 D 1 (1 / 2 2 JCH) b x x a y a • Para 13 C: z y y 5 90 x y 3 3 5 x D 2 (1 / 2 2 JCH) 5 3 • El resultado es que solo los 13 C con acoples 2 JCH van a dar correlaciones en el HETCOR y podemos ver los enlaces de larga distancia. x

HETCOR de larga distancia (. . . y mas) • Considerando que todo esta en nuestro favor, obtenemos: Hb b Ha c Hc a Ca Cb • Barbaro. Ahora vemos el acople de larga distancia, y podemos determinar cual CH 2 es cual en el alcanfor. La explicacion la hicimos para CH’s, pero eso lo mismo para CH 2’s y CH 3’s. • En realidad, nada funciona como queremos (Murphy). Esta secuencia tiene varios problemas. Primero, seleccionar los D 1 y D 2 para ver 2 JCH en vez de 1 JCH es un centro al area. • Segundo, aparte del periodo de evolucion (que es del orden de 10 a 20 ms), los periodos D 1 y D 2 son bastante mas largos. Vamos a tener un monton de relajacion de los 13 C’s, y las señales van a ser petizas. • Mas importante aun, como los 1 H’s se relajan mucho mas que los 13 C’s, la transferencia de polarizacion va a ser minima, y por lo tanto no vamos a ver correlaciones fuertes.

HETCOR-COLOC • ¿Como solucionamos esto? Si queremos usar la misma idea que hasta ahora, i. e. , reenfocar la magnetizacion de 13 C asociada con 2 JCH, tenemos que mantener a D 1 y D 2. • El unico periodo que podemos acortar, en principio, es el periodo de evolucion variable, t 1. ¿Como hacemos esto si necesitamos que este periodo crezca de experimento a experimento para obtener la segunda dimension? • La solucion es hacer un experimento de tiempo constante. Esto involucra tener un tiempo de evolucion t 1 que en total es constante e igual a D 1, pero poner pulsos de 180 dentro del periodo de evolucion y que ‘avanzen’ durante este tiempo. Un ejemplo de este tipo de secuencia es llamado COrrelations via LOng-range Couplings, o COLOC: 180 90 t 1 / 2 D 1 - t 1 / 2 13 C: 90 90 180 t 1 / 2 1 H: D 1 - t 1 / 2 D 1 D 2 {1 H}

HETCOR-COLOC (continuado) • Como se ve en la secuencia, el periodo D 1 queda igual, asi como tambien el periodo t 1 total. En cambio, logramos la evolucion en t 1 avanzando de forma constante los dos pulsos de 180 durante el periodo t 1 de experimento a experimento. • Podemos analizar como funciona la secuencia de la misma forma en que analizamos el HETCOR comun. Hacemos el analisis para un C-C-H. El primer pulso de 90 en 1 H pone a la magnetizacion de 1 H en el plano <xy>, donde evoluciona bajo el efecto de JCH (2 JCH en el caso de C-C-H) por un periodo t 1 / 2, que es variable. • La combinacion de pulsos de 180 en � 1 H y 13 C invierte la magnetizacion de 1 H y las marcas de los vectores de 1 H: y y . . . 18013 C t 1 / 2 b a x 1801 H b x a

HETCOR-COLOC (mas. . . ) • Despues de D 1 - t 1 / 2, la magnetizacion continua desfasandose. Pero como el tiempo total es D 1, vamos a tener inversion completa de la magnetizacion de 1 H, y por lo el maximo de transferencia de polarizacion de � 1 H a 13 C. Ademas, marcamos la magnetizacion de 13 C con la frecuencia de 1 H (que nos da la correlacion…). • Como siempre vamos a tener inversion completa de la magnetizacion de 1 H y reenfoque, no tenemos acoples 2 JCH en la dimension de 13 C (f 1). • Finalmente, en el periodo D 2 tenemos renfoque de la magnetizacion 13 C en antifase, de la misma forma que en el HETCOR reenfocado, y podemos desacoplar durante la adquisicion para eliminar 2 JCH en la dimension f 2: z y y 5 90 x y 3 D 2 3 5 x 5 3 • La ventaja de esta secuencia es que hacemos lo mismo que en un HETCOR pero en mucho menos tiempo porque el periodo D 1 esta incluido en la evolucion durante t 1. Es mas, en vez de aumentar t 1 de experimento a experimento, movemos sistematicamente los pulsos de 180 para obtener transferencia de polarizacion y marcado por frecuencias. x