ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL USP Purificao

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP Purificação de Produtos Biotecnológicos Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo Márcio

Etapas de um Processo de Purificação

Etapa do processo Clarificação Rompimento de células Operações unitárias Princípio Filtração convencional Centrifugação Filtração tangencial (membranas) Tamanho de partículas Tamanho e densidade de partículas Tamanho de partículas Floculação Hidrofobicidade de partículas H omegeneização Ultra-som Moagem em moinho de bolas Cisalhamento Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular Solubilidade Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas Rompimento químico ou enzimático Precipitação Purificação de baixa resolução U Itrafiltração (membranas) Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar Cromatografia de troca-iônica Cromatografia de afinidade (biológica ou química) Purificação de alta resolução Cromatografia de imunoafinidade Cromatografia de interação hidrofóbica Cromatografia de exclusão molecular Membranas adsortivas Cristalização Tratamentos finais Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção) Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo) Hidrofobicidade Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido Liofi I ização Características de equilíbrio líquido-sólido Secagem Características de equilíbrio líquido-sólido

Rompimento Celular Clarificação Suspensão Celular Produtos Intracelulares � Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento

�Aplicados após a separação e lavagem das células; �Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento; �Ex. : Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade

Forma mais adequada de Rompimento? �Tipo de microrganismo �Tamanho da célula; �Tolerância a tensões de cisalhamento; �Necessidade de controle de temperatura; �Gasto de energia;

Parede Celular

Métodos de Rompimento Celular Mecânicos • Homogeneizador de alta pressão • Moinho de bolas • Ultrassom Nãomecânicos • • Choque osmótico Congelamento-descongelamento Aquecimento Secagem Químicos • • Álcalis Solventes Detergentes Ácidos Enzimáticos • Lize enzimática

Homogeneizador a alta pressão Cavitação Turbulência Cisalhamento

Mecânico - Homogeneizador a alta pressão �Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração �Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).

Mecânico - Homogeneizador a alta pressão O desempenho pode ser afetado por: �Pressão de operação; �Velocidade de alimentação; �Temperatura; �Estado fisiológico do microrganismo; �Condições de cultivo; �Tipo de célula e sua concentração. �tamanho das células (maior => rompimento mais fácil) �pressão (maior => maior eficiência) �número de passagens (múltiplas etapas aumenta o rendimento)

Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1 a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

onde: log Rm = k. N. Pa (Rm – R) Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L) R é a concentração de proteina liberada (g/L) k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula N é o número de passagens P é a pressão

Mecânico – Moinho de Bolas �Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro. �O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.

Mecânico – Moinho de Bolas

Mecânico – Ultra-som �O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20 k. Hz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação. �Escala de laboratório.

Mecânico - Ultrassom

Rompimentos Mecânicos �Desvantagens: �As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas; �Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.